КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

НазваниеМолекулярные механизмы побочного действия антидепрессантов на репродуктивное здоровье женщин

РуководительНикишин Денис Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

КонкурсКонкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Аннотация
Депрессия – наиболее распространенное психическое расстройство в мире, в том числе в России. Женщины в два раза более подвержены депрессивным состояниям, причем риск депрессии возрастает в детородном возрасте, а беременность является уязвимым периодом, во время которого велика вероятность обострения существующей депрессии и развития новой болезни. В связи с распространенностью проблемы, важнейшей задачей является оценка безопасности применения антидепрессантов, в том числе их эффектов на репродуктивную функцию. В ходе длительного процесса оогенеза происходит не только формирование и созревание яйцеклетки, но накапливается «материальная база» для первых этапов эмбрионального развития. Важнейшей особенностью функционирования женской репродуктивной системы является то, что запас будущих яйцеклеток закладывается еще в эмбриональном периоде. С возрастом женщины, начиная с плодного периода, количество ооцитов в яичнике постоянно снижается и не способно возобновляться. Из этого следует, что все воздействия, произведенные на уже сформированный овариальный пул, необратимы и могут проявиться через много лет в репродуктивном возрасте. В свете вышесказанного, важной научной проблемой является тщательный анализ возможных последствий использования антидепрессантов как во время беременности, когда закладывается овариальный пул развивающейся девочки, так и в детском и подростковом возрасте, когда употребление антидепрессантов, зачастую, происходит неконтролируемо. Среди спектра средств, применяемых для лечения депрессии, селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС) являются препаратами первой линии терапии, причем в последние годы количество случаев их применения неуклонно возрастает. Транспортер серотонина SERT, который является главной мишенью СИОЗС, экспрессируется и функционально активен в яичнике. Показано, что прием антидепрессантов негативно сказывается на функциональной активности клеток гранулезы, которые не только являются ключевым компонентом, направляющим процесс созревания яйцеклетки, но и осуществляют эндокринную функцию, синтезируя эстроген. Среди последствий этого побочного эффекта склонность к ожирению и сахарному диабету. Однако конкретные механизмы влияния СИОЗС на клетки гранулезы остаются недостаточно изученными. Для восполнения этого пробела планируется выявить молекулярные механизмы, посредством которых антидепрессанты влияют на функционирование компонентов овариальных фолликулов в процессе их развития. Для решения этой задачи в рамках заявленного проекта будут проведены исследования корреляции активности SERT в ооците с маркерами функционального состояния и потенциала развития овариальных фолликулов, функциональных различий овариальных фолликулов с различной активностью SERT в ооцитах, механизмов опосредованного ооцитом SERT-зависимого влияния флуоксетина на экспансию кумулюса, отсроченного влияния активности SERT на созревание ооцита, SERT-независимых побочных эффектов флуоксетина, а также экспрессии мишеней антидепрессантов различных групп в яичнике. В результате выполнения поставленной задачи будут впервые получены новые данные о механизмах побочного действия антидепрессантов (прежде всего, СИОЗС) на женскую репродуктивную функцию, будет оценена степень негативного эффекта приема антидепрессантов на репродуктивное здоровье женщин и сделаны выводы о возможных последствиях их приема для последующего эмбрионального развития. Кроме того, будут получены конкретные результаты о влиянии серотонина на ход оогенеза в культуре in vitro, который будет иметь прикладное значение.

Ожидаемые результаты
В рамках заявленного проекта будет проведено комплексное исследование механизмов побочных эффектов антидепрессантов на морфо-функциональное состояние овариальных фолликулов, в том числе на созревание ооцитов и последующее эмбриональное развитие. Будет установлено влияние содержание серотонина, накопившегося в ооцитах в ходе оогенеза, не морфо-функциональные показатель качества половых клеток и их потенциала к развитию. Отдельно будут исследованы долгосрочные последствия приема антидепрессантов беременными самками на развитие потомства, в том числе на количественные показатели репродуктивного потенциала. Будет выявлена роль механизма мембранного захвата серотонина, основной мишени СИОЗС, в регуляции процессов фолликулогенеза. Кроме того, будет проверена гипотеза о Sert-независимом механизме побочных эффектов флуоксетина, связанным с прямым ингибированием канонического Wnt-сигнального пути, что имеет важное значение для оценки значения серотонинергической регуляции процессов развития. Немаловажной частью работы станет поиск мишеней других антидепрессантов разных групп, экспрессирующихся и функционально активных в яичнике млекопитающих для дальнейшего анализа механизмов их возможных побочных эффектов. В результате выполнения поставленной задачи будет не только оценена степень негативного эффекта приема антидепрессантов на репродуктивную функцию, но также будут сделаны выводы о возможных последствиях их приема для последующего эмбрионального развития. Кроме того, будут получены конкретные результаты о влиянии серотонина на ход оогенеза в культуре in vitro, который может иметь прикладное значение.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе первого года выполнения проекта проведено исследование корреляции активности SERT в ооците с маркерами функционального состояния и потенциала развития овариальных фолликулов. Cоокрашивание овариальной ткани антителами против серотонина и маркеров пролиферации, апоптоза и аутофагии показало, что различия активности захвата серотонина в ооцитах не коррелируют с показателями пролиферации и апоптоза в фолликуле, но находятся во взаимосвязи с морфо-функциональными показателями, отражающими стадию зрелости фолликула. Выявлено, что по мере созревания ооцита происходит рост активности SERT в ооцитах. Анализ методом Вестерн блоттинга показал, что в зрелых MII-ооцитах наблюдается более высокий уровень экспрессии активной гликозилированной формы транспортера серотонина SERT, нежели в незрелых GV-ооцитах. Таким образом, полученные в рамках данной задачи данные позволяют сделать вывод о том, что активность системы транспорта серотонина в ооците является показателем его зрелости. Проведено исследование влияния флуоксетина на функциональное состояние овариальной ткани в модели in vivo, которая предполагает высокую дозировку, но недолгосрочное воздействие, что позволяет исключить длительно развивающиеся побочные эффекты, связанные с влиянием на метаболизм. В эксперименте наблюдается существенное снижение экспрессии нескольких генов, которые являются показателями активности фолликулогенеза в яичнике - ароматазы Cyp19a1, рецептора ФСГ, рецептора ЛГ, и ооцитарных факторов роста Gdf9 и Bmp15, играющих существенную роль в поддержании фолликулогенеза. Выявлено, что в опыте экспрессия мРНК гена мишени флуоксетина Sert тоже снижается, что говорит о наличии в яичнике положительной обратной связи между захватом серотонина и экспрессией мембранного транспортера. Выполнено исследование экспрессии мишеней различных групп антидепрессантов в яичнике. Выявлено, что в ходе оогенеза и на ранних стадиях развития наблюдается высокая экспрессия ферментов первых этапов синтеза серотонина и дофамина Th и Tph2, а также моноаминоксидазы обоих типов и катехол-О-метилтрансфераза. Выявлено,что в оогенезе и раннем доимплантационном развитии два транспортера - мембранный транспортер серотонина Sert и везикулярный транспортер моноаминов Vmat2 - и несколько моноаминергических рецепторов обладают выраженной экспрессией: рецепторы серотонина Htr1d, Htr5a, Htr5b, Htr7, рецептор дофамина Drd3, адренорецепторы Adra2b, Adra2c и Adrb3, а также ядерный рецептор мелатонина Rora. Проведено исследование пространственного распределения серотонина, везикулярного транспортера моноаминов Vmat2 и рецепторов серотонина Htr1d и Htr2a в GV-ооцитах и эмбрионах на разных стадиях доимплантационного развития мыши. Выявлено, что как сам серотонин, так и его везикулярный транспортер Vmat2 локализуются в большей степени в кортикальном слое ооцитов и ранних эмбрионов, выявляясь в виде мелких гранул одинакового размера. Это может свидетельствовать об активности серотонина как посредника межклеточной сигнализации на поздних стадиях оогенеза и в процессе межбластомерного взаимодействия на ранних стадиях развития. Паттерн распределения Htr1d- и Htr2a-иммунопозитивных частиц резко различается: Htr1d выявляется в примембранном слое ооцитов, тогда как Htr2a окрашивается по всей цитоплазме в составе очень крупных гранул. Эти данные могут свидетельствовать в пользу того, что рецепторы выполняют различные функции: рецептор Htr1d может быть связан с межклеточной коммуникацией на ранних стадиях развития, а Htr2a – с метаболическими процессами во внутриклеточных структурах. В отчетный период проведен анализ содержания серотонина в незрелых GV-ооцитах из яичников и зрелых постовуляторных MII-ооцитов из яйцеводов, выделенных из контрольных мышей и из самок, подвергавшихся воздействию флуоксетина в течение 7 дней. Выявлено, что содержание серотонина в MII-ооцитах контрольных самок в среднем в 4 раза выше, чем в GV-ооцитах, тогда как у опытных самок уровень содержания серотонина в GV- и MII-ооцитах не различается, и соответствует уровню контрольных GV-ооцитов. Полученные результаты подтверждают предположение о том, что активный захват серотонина происходит после овуляции зрелыми ооцитами, и практически не реализован в составе созревающих фолликулов. Проведен анализ зависимости содержания накопленного в ооцитах серотонина от концентрации его в среде. Выявлено, что ооциты достоверно увеличивают внутриклеточное содержание серотонина при его концентрации в окружающей среде от 25 нМ, и при удалении серотонина из среды его содержание в ооцитах постепенно снижается, достигая базового уровня через 24-36 ч. Таким образом подобраны оптимальные условия протоколов, в результате которых будут получены ооциты с повышенным и пониженным содержанием серотонина, которые в дальнейшем будут исследованы на предмет изменений морфологических и функциональных характеристик, в каждом подходе, по сравнению с контрольными гаметами. Изучена динамика изменения содержания серотонина в культуральной среде Выявлено, что концентрация серотонина снижается медленно, не более, чем на 20% через 24 часа инкубации. Изучено влияние серотонина на функциональное состояние клеток гранулезы в первичной культуре. Выявлено, что три гена достоверно изменяют уровень экспрессии мРНК в ответ на серотонин: маркеры клеток кумулюса Has2 и Ptrgs2, и регулятор клеточного цикла циклин D (Ccnd1). Исследована активность систем мембранного транспорта и деградации серотонина в первичной культуре клеток гранулезы. Выявлено, что в клетках гранулезы происходит захват серотонина мембранным транспортером SERT и последующая активная деградация серотонина моноаминоксидазами.

Публикации

1. Алёшина Н.М., Русанова В.Р., Мальченко Л.А., Храмова Ю.В., Никишина Ю.О., Кондукторова В.В., Евстифеева А.Ю., Никишин Д.А. Анализ экспрессии генов-маркеров яичника выявил антагонистические эффекты серотонина и андростендиона на функциональный статус клеток гранулезы мыши в первичной культуре Онтогенез / Russian Journal of Developmental Biology, - (год публикации - 2023)

2. Алешина Н.М., Ткаченко М.Д., Мальченко Л.А., Шмуклер Ю.Б., Никишин Д.А. Uptake and Metabolization of Serotonin by Granulosa Cells Form a Functional Barrier in the Mouse Ovary International Journal of Molecular Sciences, V. 23, № 23, P. 14828 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms232314828