КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-10036

НазваниеРазработка многопараметрических биофизических тестов для исследования функции рецепторов, сопряжённых с G белком

РуководительМишин Алексей Викторович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2022 - 06.2025

Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика

Ключевые словаБиофизические функциональные тесты активности рецепторов, молекулярные механизмы функционирования, рецепторы, сопряжённые с G белком (GPCR); экспрессия белка, интегральные мембранные белки, рациональная разработка и скрининг лекарственных средств, микромасштабный термофорез, времяразрешённый резонансный перенос энергии (FRET, BRET, HTRF),масс-спектрометрия, дифференциальная сканирующая флуориметрия

Код ГРНТИ34.15.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Исследования мембранных белков in vitro всегда сдерживались трудностями получения чистых образцов и сложностью организации функциональных анализов на основе клеток и выделенных препаратов очищенного белка. Важнейшими трансмембранными белками в организме человека являются многочисленное суперсемейство рецепторов, сопряжённых с G белком (GPCR), функция которых заключается в передаче сигналов внутрь клетки. Данные рецепторы участвуют в регуляции всех основных функций организма и являются наиболее заметной группой терапевтических мишеней. Однако высокая конформационная подвижность и низкая термостабильность этих рецепторов всегда представляли серьезные проблемы для их экспериментальной характеризации. Подготовка образцов требует существенных усилий в белковой инженерии для разработки конструкций GPCR, подходящих для использования в экспериментальных исследованиях. Проект посвящён созданию и адаптацию палитры биофизических методик для проведения функциональных тестов для GPCR, которые давали бы важную комплементарную по отношению к структуре информацию о молекулярных механизмах работы рецептора и активируемого им сигнального пути. Наши анализы включают методики измерения констант связывания и изучение вторичных мессенджеров и партнеров по взаимодействию при формировании комплексов, а также полезны для изучения аллостерических лигандов и смещённой передачи сигнала (biased signalling), что является горячей темой в разработке лекарств для GPCR мишеней. В прикладном аспекте, настоящий проект направлен на принципиальное улучшение методов тестирования взаимодействия GPCR рецепторов c направленными на них лекарственными средствами при помощи использования биофизических методов исследования. Протоколы, которые мы разрабатываем, почти повсеместно могут быть перенесены на изучение многих других важных классов мембранных белков.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены комплементарные к структуре функциональные данные о молекулярных механизмах функционирования целевых GPCR, включающие анализ "структура-функция" (structure-activity relationship, SAR) ключевых для рецептора мутаций, предсказанных по структуре и в геномных базах данных соматических мутаций, в том числе канцерогенных. Будут адаптированы и оптимизированы методики проведения клеточных и in vitro функциональных тестов. Предлагаемые подходы создаются для рациональной разработки прототипов лекарственных средств нового поколения (на стадии hit и lead compounds, направленных на исправление дисфункций, ассоциированных с данными рецепторами) и отвечают передовому мировому уровню в области рациональной разработки лекарственных средств. В рамках выполнения работ по проекту будет сформирована научная группа из специалистов в разных комплементарных аспектах исследований мембранных белков. Объединенный междисциплинарный опыт команды будет являться существенным преимуществом и позволит опубликовать результаты проекта в ведущих мировых научных журналах из первого квартиля по импакт-фактору. Результаты, полученные в этом исследовании, станут новыми и представляют большой интерес как для академических ученых, так и для индустрии.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В первый год выполнения проекта были проведены подготовительные эксперименты, необходимые для разработки многопараметрических биофизических функциональных тестов для целевых GPCR. Были смоделированы и созданы генетические конструкции целевых рецепторов, подобраны условия их экспрессии в различных эукариотических системах и разработаны протоколы подготовки образца для in vitro исследований. Получены и проанализированы данные многопараметрической характеризации целевых GPCR рецепторов при помощи методов nanoDSF, реализованных с помощью комплекса оборудования Nanotemper Prometheus Panta. В рамках проекта проведены клеточные функциональные тесты для аденозинового A2a рецептора и его мутантных форм, а также для сфингозин-фосфатного рецептора 5-го типа S1P5. Данные работы нашли своё отражение в соответствующих разделах статей, опубликованных в высокорейтинговых журналах Communications Biology и Nature Communications. Результаты проекта представлялись в рамках пленарного доклада на Международной научной конференции Protein Structure Determination in Industry 2022.

Публикации

1. Елизавета Ляпина ... Александра Лугинина .... Полина Хорн, Михаил Шевцов, Кирилл Ковалев, Сергей Бухдрюкер, Иван Охрименко ... Иван Гущин, Андрей Рогачев,… Валентин Борщевский, Алексей Мишин, Вадим Черезов Structural basis for receptor selectivity and inverse agonism in S1P5 receptors Nature Communications, Nat Commun 13, 4736 (2022). (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1038/s41467-022-32447-1

2. Маслов Иван, Полина Хорн, Орехов Филипп, Анастасия Гусач, Павел Кузьмичев, Андрей Герасимов, Александра Лугинина, Андрей Богородский, Валентин Горделий,... Алексей Мишин, ...Вадим Черезов, .... Валентин Борщевский Sub-millisecond conformational dynamics of the A2A adenosine receptor revealed by single-molecule FRET Communications Biology, Commun Biol 6, 362 (2023). (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1038/s42003-023-04727-z

3. Дмитриева Дарья, Котова Татьяна, Сафронова Надежда, Садова Александра, Дмитрий Дашевский, Алексей Мишин Protein Design Strategies for the Structural–Functional Studies of G Protein-Coupled Receptors Biochemistry Moscow, Biochemistry Moscow 88 (Suppl 1), S192–S226 (2023). (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1134/S0006297923140110

4. - Разработана методика наблюдений за работой белковых "переключателей" ТАСС Наука, - (год публикации - )

5. - В МФТИ изучили все «па» рецептора аденозина Пресс-служба РНФ, - (год публикации - )

6. - Ученые МФТИ открыли секрет управления важным рецептором Пресс-служба РНФ, - (год публикации - )

7. - Ученые МФТИ открыли секрет управления важным рецептором Журнал Занаука, - (год публикации - )