КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-10047

НазваниеЦельноклеточные бактериальные биосенсоры на основе гибридных, стрессовых промоторов для исследовательских и прикладных задач

РуководительБаженов Сергей Владимирович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2025 

Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-210 - Молекулярная генетика

Ключевые словаБактерии, регуляция, промотор, гибрид, биосенсор

Код ГРНТИ34.15.27

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Настоящий проект посвящен изучению свойств бактериальных индуцируемых промоторов грамположительных бактерий Bacillus subtilis и грамотрицательных бактерий Escherichia coli, разработке новых гибридных промоторов для цельноклеточных биосенсоров. Новые биосенсоры будут использованы данном проекте для: исследования способности антибиотиков и биологически активных веществ к активации окислительного стресса в бактериальных клетках и способности ферритина защищать клетку от него; исследования механизмов токсичности каркасно-напряженных углеводородов; исследования влияния про- и антиоксидантных веществ на бактериальную клетку; исследования роли метионин-гамма-лиаз quorum sensing ответе патогенных бактерий. Планируется исследовать ряд стресс-индуцируемых промоторов бактерий B. subtilis и оценить их применимость для создания цельноклеточных биосенсоров и последующего анализа механизмов токсичности различных химических соединений и поиска токсикантов в загрязненных почвах, что невозможно выполнить с использованием ранее сконструированных биосенсоров на основе грамотрицательных E. coli. В результате выполнения проекта предполагается получить расширенный набор цельноклеточных биосенсоров на основе грамположительных и грамотрицательных бактерий и исследовать с его помощью токсичность и механизмы токсичности каркасно-напряженных углеводородов, являющихся перспективными компонентами ракетного топлива, а так же удобрения, некоторые моющие вещества и компоненты медицинских препаратов. Важность создания наборов цельноклеточных биосенсоров определяется 2 факторами: 1) исследование функции промоторов в клетках и их взаимной индукции; 2) создание инструмента для экологического контроля и определение биодоступных токсикантов в среде. Способность проводить оценку биодоступности токсикантов является ключевым преимущество бактериальных биосенсоров перед физическими методами определения химсостава сред. В рамках решения задачи по расширению набора цельноклеточных биосенсоров на основе грамотрицательных бактерий впервые предполагается сконструировать принципиально новый гибридный промотор на основе операторных участков промоторов оперонов isc и suf бактерий E. coli для создания цельноклеточного биосенсора, чувствительного к уровню окисленных/восстановленных Fe-S кластеров в клетке, который является индикатором окислительного стресса в клетке. Сочетание репрессии комплексом IscR-Fe-S и активации белком apo-IscR, как предполагается, приведет к получению улучшенных параметров цельноклеточного биосенсора, в частности обладающего повышенной чувствительностью, скоростью и амплитудой ответа на изменение концентрации восстановленных Fe-S кластеров в клетке. Так же планируется сконструировать биосенсор на основе промоторов генов dinA и dinB E. coli, кодирующих ДНК-полимеразы II и IV и являющегося индикатором SOS-ответа, а также биосенсор на основе промотора гена ftnA E. coli, кодирующего основной ферритин. В рамках решения задачи по расширению набора цельноклеточных биосенсоров на основе грамположительных бактерий предполагается сконструировать гибридные биосенсорные плазмиды на основе промоторов генов yneA, katB, katA, ucgJ (набор используемых промоторов может быть расширен в процессе выполнения работ). В рамках исследования различных химических соединений предполагается провести следующие работы: 1) Известно, что некоторые антибиотики способны вызывать окислительный стресс в бактериальных клетках. Это было показано на грамотрицательных бактериях. В рамках данного проекта будет проведена проверка воздействия этих антибиотиков на грамположительные клетки и основанные на них цельноклеточные биосенсоры. 2) Ряд медицинских препаратов может быть способен оказывать влияние на пул АТФ и НАДН в клетке. Предполагается исследовать эти процессы с помощью цельноклеточных биосенсоров с конститутивными промоторами и бактериальной и светлячковой люциферазами, светимость которых специфически зависит от концентрации НАДН и АТФ, соответственно. 3) Предполагается, что ферритин способен защищать клетку от окислительного стресса. Будет проведено исследование ферритина бактерий E. coli: будет изучена способность окислительного стресса влиять на его экспрессию, а также будет определена способность ферритина, продуцируемого внутри клеток E. coli защищать их от активных форм кислорода и повышать их устойчивость к окислителям и воздействию ряда антибиотиков. 4) Предполагается, что метионин-гамма-лиаза (МГЛ), являющаяся кандидатным ферментом для терапии рака, способна ингибировать работу системы чувства кворума (QS). В рамках проекта будут проведены исследования влияния MGL на работу QS системы Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei в гетерологичной системе клеток E. coli и QS системы в клетках A. logei. За работу QS системы I типа в бактериях A. fischeri и A. logei отвечают регуляторные белки LuxR-семейства. К настоящему моменту функция этих регуляторных белков из бактерий Aliivibrio достаточно хорошо изучена, в том числе группой авторов данной заявки, однако структуры этих белков все еще нет. В рамках настоящего проекта предполагается провести структурные исследования с целью улучшения понимания функции LuxR-белков и дальнейшей их модификации для решения биотехнологических задач. На завершающем этапе проекта будут проведены полевые испытания сформированного и охарактеризованного в лабораторных условиях набора цельноклеточных биосенсоров. В частности предполагается провести исследования ряда водоемов Подмосковья и принять участие в комплексной экологической экспедиции на оз. Байкал, организуемой институтом проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН.

Ожидаемые результаты
В рамках настоящего проекта предполагается разработать ряд цельноклеточных биосенсоров на основе грамположительных бактерий вида B. subtlis и грамотрицательных бактерий E. coli и провести ряд исследований с их применением. Комплекс таких специфически индуцируемых биосенсоров сможет позволить решать ряд задач: - детальное исследование регуляции выбранных промоторов; - анализ загрязнения окружающей среды (в том числе почв) различного типа токсикантами и оценка степени опасности различных соединений (примером могут служить загрязнения компонентами ракетного топлива, промышленными моющими средствами и удобрениями); - исследование влияния лекарственных средств и биологически активных соединений на клетку, исследование механизмов токсического воздействия на клетку новых химических соединений. - оценка протекторных свойств различных химических соединений - перспективных как медицинские препараты и клеточных белков. В частности ожидается получить следующие результаты: - обзор используемых в настоящее время цельноклеточных биосенсоров; - принципиально новый гибридный промотор на основе элементов промоторов оперонов suf и isc клеток E. coli и оценка его пригодности для мониторинга для детекции агентов, вызывающих окислительный стресс. Ожидается повышение чувствительности гибридного промотора по сравнению с каждым из исходных за счет комбинирования операторных участков для двух форм (apo и holo) одного и того же белка IscR. - Биосенсорные плазмиды, в которых репортерные гены находятся под контролем промотора ферритина (ftnA) и полимераз II и IV (dinA и dinB) клеток E. coli. С помощью сконструированных биосенсоров будут исследованы параметры выбранных промоторов, в том числе индукция в ответ на окислительный стресс различной природы. Результаты данного исследования позволят оценить пригодность данных промоторов для дальнейшего использования в составе биосенсорных штаммов. Известно, что в ответ на окислительный стресс экспрессия ферритинов усиливается в клетках млекопитающих, для бактерий аналогичный результат был показандля ДНК-связывающих ферритинов, к которым FtnA не относится. Результаты данного исследования должны ответить на вопрос о фундаментальном характере активации экспрессии ферритина в ответ на окислительный стресс. - Результаты исследования способности ферритина FtnA, не обладающего способностью к связыванию с ДНК, защищать клетку от окислительного стресса. На сегодняшний день такое свойство было описано только для ДНК-связывающих ферритинов, данные результаты имеют фундаментальный характер. - Биосенсорные штаммы на основе промоторов генов yneA, katB, katA, ucgJ B. subtilis и основные их характеристики. Расширение ряда грамположительных цельноклеточных биосенсоров при совместном использовании с существующими грамотрицательными биосенсорами позволит проводить комплексные исследования влияния химических соединений на микробные сообщества. - Результаты проверки способности ряда антибиотиков (гентамицин, тетрациклин, канамицин, норфлоксацин и др.) вызывать окислительный стресс в грамотрицательных и грамположительных бактериях с использованием как ранее созданных, так и разработанных в рамках настоящего проекта цельноклеточных биосенсоров индуцируемых биосенсоров. - Результаты исследования воздействия биологически активных веществ (в частности, SkQ1) на грамположительные и грамотрицательные бактериальные клетки с использованием АТФ и НАДН-зависимых люцифераз. - Результаты исследования влияния метионин-гамма-лиазы на работу системы чувства кворума первого типа. На текущий момент подобные исследования не проводились и существует лишь теоретически обоснованное предположение, что МГЛ должна ингибировать синтез аутоиндуктора (АИ). Данный результат будет получен с использованием ряда цельноклеточных биосенсоров на основе клеток E. coli и на природных штаммах, обладающих QS системой. Полученные данные прольют свет на взаимное влияние процесса патогенеза с разрушением тканей хозяина бактериальными ферментами и процесса коммуникации бактерий за счет синтеза АИ. - Результаты структурных исследований регуляторных белков LuxR-семейства бактерий A. logei. Эти результаты важны для лучшего понимания функционирования данных белков и помогут в дальнейшем осуществлять белковую инженерию и перепрограммировать эти регуляторные белки для распознавания определенных последовательностей ДНК. - Результаты экологических исследований. Данные результаты будут актуальны как в качестве доказательства применимости разработанных биосенсоров, так и в качестве индикатора состояния окружающей среды в обследуемых местах (в частности, предполагается провести работы на оз. Байкал).

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Основное направление данного проекта ― развитие и применение технологии цельноклеточных lux-биосенсоров. Цельноклеточными биосенсорами называют клетки, в которых репортерные гены, кодирующие белки, активность которых легко измерить, клонированы под контролем индуцибельных или конститутивных промоторов. Наибольшую амплитуду ответа и чувствительность биосенсоров обеспечивает использование генов бактериальной люциферазы в составе полного luxCDABE оперона (lux-биосенсоры). При использовании индуцибельных промоторов ответ оценивается по увеличению люминесценции, вызванному индукцией экспрессии генов люциферазы под контролем стрессового промотора. Полуспецифические биосенсоры способны детектировать повреждения ДНК, белков, мембран и липидов и окислительный стресс в клетке. Специфические биосенсоры позволяют детектировать ионы металлов, антибиотики, сигнальные молекулы QS-систем, метаболиты и витамины. На сегодняшний день разработано значительное количество полуспецифических и специфических биосенсоров, но зачастую встречается использование различных генов-репортеров, что затрудняет объединение этих биосенсоров в единые наборы, а также наблюдается нехватка биосенсоров на основе клеток других видов, помимо E. coli (разные бактерии лучше приспособлены к обитанию в разных средах и имеют разную восприимчивость к определенным веществам, что обуславливает актуальность расширения линейки lux-биосенсоров). Анализ литературы показал, что в мире активно идет работа над решением данных проблем и наборы биосенсоров расширяются, в том числе и за счет создания эукариотических люминесцентных биосенсоров. Помимо решения прикладных задач, конструирование цельноклеточных биосенсоров позволяет исследовать механизмы регуляции отдельных генов. В рамках проекта был подготовлен обширный обзор научной литературы по теме конструирования и применения lux-биосенсоров и опубликован в профильном научном журнале Biosensors and Bioelectronics X (Q1). Цельноклеточные биосенсоры широко используются как в виде клеточной суспензии, так и в составе сложных устройств, позволяющих осуществлять проточный анализ жидкости (например, водопроводной воды) и многое другое. Подробно были рассмотрены области, в которых индуцируемые цельноклеточные биосенсоры используются, в частности lux-биосенсоры можно использовать для исследований защитных свойств химических соединений, с помощью биосенсоров проводят поиск новых пробиотиков и пребиотиков, исследуют токсичность и свойства новых соединений, используются в экотоксикологических исследованиях и другое. В том числе показана возможность применения цельноклеточных биосенсоров для контроля качества и исследований в пищевой промышленности, однако пока широкое применение ограничено из-за отсутствия нормативной базы и готовых решений для коммерческого применения. По результатам обзора литературы был уточнен список промоторов B. subtilis для создания биосенсоров (PyneA, PkatB, PkatA, PohrA) и были проведены генно-инженерные работы по клонированию их вместе с генами-репортерами в векторах, способных к репликации в клетках E. coli и B. subtilis. Оперон yneABC является частью SOS-регулона в B. subtilis. Экспрессия гена yneA вырастает при SOS-ответе в клетках, а белок YneA отвечает за подавление клеточного деления при остановке репликационной вилки в клетках B. subtilis. Промотор к гену katA был выбран, так как этот ген является частью пероксидного регулона в клетках B. subtilis. Он кодирует каталазу 1, которая отвечает за деградацию пероксида водорода. Ген katB кодирует каталазу 2. Экспрессия katE повышается при воздействии температуры, солей, этанола, либо при глюкозном голодании. Потенциально промотор может оказаться перспективным для создания биосенсора, детектирующего денатурацию белков, тепловой шок. Промотор к гену ohrA регулируется пероксид-чувствительным белком репрессором OhrR, чувствительным к органическим пероксидам, но при этом не индуцируется в присутствии пероксида водорода в отличие от PkatA. Новые биосенсоры были сконструированы на основе клеток E. coli и промоторов генов ферритина ftnA и ДНК-полимераз II и IV. В частности, это позволит на втором этапе проекта исследовать регуляцию экспрессии ферритина А в клетках E. coli в условиях окислительного стресса и сравнить свойства промоторов двух ДНК полимераз, участвующих в репарации повреждения ДНК. Для выявления роли ферритина А в защите клеток от окислительного стресса и действия антибиотиков, в том числе вызывающих окислительный стресс, генно-инженерными методами был получен штамм E. coli, содержащий ген ферритина А под сильным конститутивным промотором, что позволит сравнивать устойчивость клеток к внешним воздействиям при разном содержании ферритина, но без сверхэкспрессии белка, ингибирующей рост культуры клеток. Для дальнейшего развития биосенсорных технологий в области систем Quorum Sensing (QS) в данном проекте проводятся исследования структуры регуляторных белков LuxR бактерий рода Aliivibrio. На первом этапе был проведен дизайн и были сконструированы генетические конструкции для биосинтеза наиболее эффективных регуляторных белков LuxR Aliivibrio fischeri и LuxR2 Aliivibrio logei в клетках E. coli для последующей их очистки и структурных исследований. Был проведен анализ литературы по теме IscR-зависимой регуляции транскрипции. За усвоение железа и образование железно-серных кластеров ([2Fe-2S]) в клетках E. coli ответственны два оперона: iscRSUA-hscBA-fdx и sufABCDSE. Белок IscR участвует в регуляции обоих оперонов. Связывание IscR с ДНК в промоторной области может как репрессировать транскрипцию, так и активировать в зависимости от связывания белка IscR с лигандом - [2Fe-2S] кластером и расположением сайта связывания относительно -35 и -10 участков промотора. IscR в клетках существует в двух формах: holo-IscR, форма IscR, связанного с Fe-S кластером, и apo-IscR, без лиганда. В зависимости от связывания с лигандом IscR распознает два различных сайта посадки, названных I и II типами. Сконструированы гибридные промоторы с использование IscR-связывающих операторных участков I и II типа (в частности взятых из промоторов оперонов isc и suf) для получения биосенсорной плазмиды с улучшенной чувствительностью к состоянию Fe-S кластеров в клетке (репрессия в нормальных условиях + индукция в условиях окислительного стресса). В дальнейшем все сконструированные в рамках проекта биосенсоры будут охарактеризованы и будут сравнены с уже существующими lux-биосенсорами для формирования сводного набора цельноклеточных биосенсоров для различных исследований. На втором этапе проекта планируется прикладное использование lux-биосенсоров для анализа воздействия фермента метионин-гамма-лиазы (МГЛ) на системы quorum sensing LuxR/LuxI типа. В связи с повышенным интересом исследователей к оральному приему МГЛ встает вопрос о влиянии препарата на QS. В обзорной работе (Bin et al., 2020) была предложена гипотеза, что так как L-метионин и S-аденозилметионин являются прекурсорами для синтеза бактериальных молекул AI-2 и AHL для QS систем, то дефицит L-метионина может привести к ингибированию QS системы, в том числе отвечающей за регуляцию вирулентности у патогенных бактерий. В данном проекте будет исследовано влияние рекомбинантного фермента L-метионин-гамма-лиазы на QS-систему. Для этого на первом году выполнения проекта была сконструирована плазмида для биосинтеза фермента МГЛ с His-tag меткой и был наработан и очищен целевой белок в количествах достаточных для проведения запланированных работ с использованием биосенсоров, моделирующих работу QS.

 

Публикации

1. Баженов С.В., Новоятлова У.С., Щеглова Е.С., Празднова Е.В., Мазанко М.С., Кессених А.Г., Конончук О.В., Гнучих Е.Ю., Лью Ю., Аль Ибрахим Р., Завильгельский Г.Б., Чистяков В.А., Манухов И.В. Bacterial lux-biosensors: Constructing, applications, and prospects Biosensors and Bioelectronics: X, V. 13, 100323 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.biosx.2023.100323

2. Сударев В.В., Долотова С.М., Бухалович С.М., Баженов С.В., Рижиков Ю.Л., Уверский В.Н., Бондарев Н.А., Осипов С.Д., Михайлов А.Е., Куклина Д.Д., Муругова Т.Н., Манухов И.В., Рогачев, А.В., Горделий В.И., Гущин И.Ю., Куклин А.И., Власов А.В. Ferritin self-assembly, structure, function, and biotechnological applications International Journal of Biological Macromolecules, V. 224, Pages 319-343 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.10.126