КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 22-74-10055

НазваниеЭпигеномные и транскриптомные особенности мобилома Arabidopsis thaliana в стрессовых условиях и его взаимодействие с РНК клетки

РуководительКиров Илья Владимирович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2025 

Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые словамобилом, растения, транспозоны, нанопоровое секвенирование, интерактомика, эпигенетика, арабидопсис, GAG белок

Код ГРНТИ34.15.23


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В отличие от животных, растения не могут быстро сменить ареал обитания в случае воздействия стрессовых факторов. Поэтому важнейшим механизмом адаптации растений к меняющимся условиям среды и долговременным стрессам является своевременное появление новых генотипов, более устойчивых к действующему стрессу. Как показывают исследования, важнейшую роль в увеличении генетического разнообразия растений в ответ на стресс играют мобильные элементы генома. Мобильные элементы (мобилом) растений изучаются на уровне их организации в геноме более полувека. Сегодня мы знаем, что мобилом – это одна из главных движущих сил эволюции растений и первопричина появления многих полезных признаков сельскохозяйственных растений. Новые инсерции мобильных элементов вносят огромный вклад в генетическую вариабельность, появление новых генов и транскрипционных программ, тем самым играя важную роль в адаптации растений к новым экологическим нишам и меняющимся условиям среды. Но, несмотря на это, мобильные элементы остаются самой малоизученной частью генома. Поэтому системное изучение закономерностей формирования мобилома растений, эпигеномных и транскриптомных изменений, вызванных новыми инсерциями в стрессовых условиях, а также взаимодействие мобильных элементов с РНК клетки – это актуальные фундаментальные вопросы современной биологии, поиск ответов на которые и является целью нашего проекта. В рамках проекта впервые будет исследовано, как мобилом растений формируется в ответ на стресс, включая образование новых инсерций, и как этот процесс связан с транскрибирующимися локусами генома. Для этого нами будет проведена активация мобильных элементов биотическими и абиотическими стрессами. Затем, используя нанопоровое секвенирование ДНК и проведя анализ изменений мобилома и транскриптома, мы впервые ответим на вопросы о связи типа стресса, транскрипции и активности мобильных элементов. Один из основных вопросов проекта - это как новые инсерции мобильных элементов влияют на метилирование ДНК и транскрипцию генов в месте вставки. Для ответа на этот вопрос мы, используя новейший подход, впервые получим уникальную коллекцию растений с новыми инсерциями мобильных элементов после разных типов стресса. Полученные растения послужат материалом для ответа на вопрос об особенностях метилирования ДНК, транскрипции, а также структуры транскриптов в местах инсерций. При этом будет использована информация, собранная с сотен новых инсерций. Для этого будет проведено нанопоровое секвенирование генома и транскриптома этих растений. Важнейшим и совершенно не изученным на сегодня вопросом, на который мы частично ответим в результате выполнения нашего проекта, является взаимодействие РНК клетки и мобильных элементов в ходе их жизненного цикла. Для этого мы создадим линии растений-трансформантов, экспрессирующих белок (GAG) оболочки вирусоподобной частицы активного (EVD) и «доместицированного» (Crtg10) ретротранспозонов. Белки GAG часто экспрессируются в ответ на стресс. Главные естественные функции этого белка – связываться с РНК и формировать вирусоподобную частицу в процессе транспозиции ретротранспозона. Мы проведём иммунопреципитацию РНК клетки, ассоциированных с белками GAG. Это позволит впервые сказать какие РНК клетки могут ассоциироваться с вирусоподобными частицами ретротранспозонов и каковы их особенности. Полученные результаты откроют новые горизонты в исследовании биологии мобильных элементов и их взаимодействиия с молекулярными системами клетки. Ещё одним важным результатом этой части проекта будут уникальные сведения о клеточной локализации GAG белка Crtg10 и о его РНК партнерах. Это в свою очередь заложит фундамент для последующих глубоких исследований функции GAG белка Crtg10 у растений.

Ожидаемые результаты
В рамках проекта впервые будет исследовано как мобилом растений формируется в ответ на стресс, включая образование новых инсерций, и как этот процесс связан с транскрибирующимися локусами генома. Результаты исследований будут особенно важны в свете роли мобильных элементов в адаптации растений, т.к. покажут есть ли взаимосвязь между местом инсерции и видом стресса. Это в свою очередь поможет сформировать концепцию использования активации мобильных элементов для расширения генетического разнообразия сельскохозяйственных культур. Будет создана уникальная коллекция растений с новыми инсерциями мобильных элементов после разных типов стресса. Это позволит как в рамках данного проекта, так и в будущих исследованиях проводить комплексные исследования мобилома и функциональные исследования генов, подвергшихся инсерциям. Нами впервые будет показана полноценная картина влияния инсерций мобильных элементов на метилирование ДНК и транскрипцию в месте вставки. При этом будет использована информация, собранная с сотен новых инсерций, полученных в результате запуска активности мобильных элементов в лабораторных условиях после разных стрессов. Полученные результаты позволят открыть новые механизмы влияния инсерций мобильных элементов на функциональные гены. Нами впервые будут получены уникальные данные по физическому взаимодействию транскриптома и вирусоподобных частиц ретротранспозонов клетки. Это позволит впервые сказать какие РНК клетки могут ассоциироваться с вирусоподобными частицами ретротранспозонов и каковы их особенности. Полученные результаты откроют новые горизонты в исследовании биологии мобильных элементов и их взаимодействия с молекулярными системами клетки. Ещё одним важным результатом этой части проекта будут уникальные сведения о клеточной локализации белка GAG Crtg10 и о его РНК партнерах. Это в свою очередь заложит фундамент для последующих глубоких исследований функции Crtg10 у растений. В данном проекте будет использована технология активации и закрепления новых инсерций мобильных элементов в последующих поколениях. Полученные знания позволят в дальнейшем использовать такой подход для расширения фенотипического разнообразия сельскохозяйственных культур.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На первом этапе проекта были проведены исследования в нескольких направлениях: (1) определение изменений мобилома Arabidopsis thaliana в стрессовых условиях после биотического (флагеллин) и абиотического (абсцизовая кислота и тепловой шок) стрессов; (2) изучение связи между новыми сайтами инсерций мобильных элементов и экспрессии генов в стрессовых условиях и (3) отбор гомозиготных растений трансформантов, несущих ген белка GAG активного транспозона EVD слитого с эпитопом 3xflag (evdGAG-FLAG и FLAG-evdGAG), и создание генетических конструкций для получения трансгенных растений экспрессирующих «доместицированный» белок GAG (Crtg10) слитый с эпитопом 3xflag (Crtg10-FLAG и FLAG-Crtg10). Для изучения динамики мобилома растений в стрессовых условиях нами было проведено выделение внехромосомных кольцевых ДНК, маркеров мобилома, из растений арабидопсиса, подвергнутых различным стрессам: тепловой стресс (HS), обработка флагеллином (Flg) и обработка абсцизовой кислотой (ABA). Было проведено нанопоровое секвенирование вкДНК и показано, что состав мобилома значительно не меняется при воздействии ABA и Flg. В тоже время, тепловой стресс индуцирует существенные изменения в составе мобилома. При этом активируется ретротранспозоны семейства ONSEN, которые генерируют вкДНК и образуют, которые неравномерно локализуются в геноме A.thaliana. Для изучения динамики мобилома на уровне структуры кольцевых ДНК по данным нанопорового секвенирования нами был впервые разработан пайплайн (https://github.com/Kirovez/eccStructONT). Проведённый анализ впервые показал, что мобильные элементы EVD и ONSEN в условиях теплового стресса у ddm1 генерируют различные по структуре вкДНК, включая полноразмерные и усечённые вкДНК. ВкДНК ONSEN в большей степени чем вкДНК EVD представлены усечёнными молекулами, которые соответствуют LTR последовательностям. Изучение вкДНК у растений дикого типа, подвергнутых тепловому стрессу, показало, что мобильные элементы ONSEN генерируют преимущественно усечённые вкДНК. Таким образом, мы впервые показали, что не только количество, но композиция мобилома на уровне вкДНК существенно меняется под действием теплового стресса и может отличаться у растений дикого типа и мутантов арабидопсиса по генам, вовлечённым в метилирование ДНК. Для выявления связи между локализации инсерций мобильных элементов в разных стрессовых условиях с транскрипционно-активными регионами был проведён RNAseq анализ и анализ новых инсерций транспозонов. RNAseq анализ выявил несколько тысяч генов с повышенной и пониженной экспрессией на 8, 16 и 24 час после начала теплового стресса. Был проведён интегрированный анализ новых инсерций транспозонов семейства ONSEN и генов, со значительными изменениями экспрессии в условиях теплового стресса. Полученные результаты впервые показывают, что гены с пониженной экспрессией в условиях теплового стресса имеют значительно больше шансов, приобрести инсерции ONSEN, чем гена с повышенной экспрессией. Такая необычная картина может быть объяснена вытеснением гистона H2A.Z, главной мишени для ONSEN, у генов с повышенной экспрессией в условиях теплового стресса в следствии связывания с транскрипционным фактором HSFA1. Наши исследования впервые демонстрируют, что паттерн экспрессии генов в стрессовых условиях может влиять на вероятность приобретения ими инсерций транспозонов.

 

Публикации

1. Киров И.В. НОВЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МОБИЛОМА РАСТЕНИЙ И ЕГО ДИНАМИКИ АНО «Иннов. центр Кольцово», Киров И.В.: НОВЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МОБИЛОМА РАСТЕНИЙ И ЕГО ДИНАМИКИ, IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков,с. 22, 2022 (год публикации - 2022)

2. Меркулов П.Ю, Егорова Е.Г., Киров И.В. Внехромосомная жизнь ретротранспозонов растений XVII Курчатовская междисциплинарная молодежная научная школа, Меркулов П.Ю, Егорова Е.Г., Киров И.В.: Внехромосомная жизнь ретротранспозонов растений, Сборник аннотаций XVII Курчатовской Молодежной Научной Школы, с 153, 2023 (год публикации - 2023)

3. Меркулов П.Ю., Егорова Е.Г., Серганова М.А., Петров Г.А., Киров И.В. ПОЙМАЙ МОБИЛОМ, ЕСЛИ СМОЖЕШЬ ФГБНУ ВНИИСБ, Меркулов П.Ю., Егорова Е.Г., Серганова М.А., Петров Г.А., Киров И.В.: ПОЙМАЙ МОБИЛОМ, ЕСЛИ СМОЖЕШЬ, 22-я Всероссийская конференция молодых учёных Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии, с 42, 2022 (год публикации - 2022)

4. Меркулов Павел, Софья Гварамия, Роман Комахин, Мурад Омаров, Максим Дудников, Алина Кочешкова, Захар Константинов, Александр Соловьев, Геннадий Карлов, Михаил Дивашук, Илья Киров Cas9-targeted Nanopore sequencing rapidly elucidates the transposition preferences and DNA methylation profiles of mobile elements in plants biorxiv, Pavel Merkulov, ... & Ilya Kirov: Cas9-targeted Nanopore sequencing rapidly elucidates the transposition preferences and DNA methylation profiles of mobile elements in plants, bioRxiv, 2023 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1101/2021.06.11.448052