Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На первом этапе проекта были проведены исследования в нескольких направлениях: (1) определение изменений мобилома Arabidopsis thaliana в стрессовых условиях после биотического (флагеллин) и абиотического (абсцизовая кислота и тепловой шок) стрессов; (2) изучение связи между новыми сайтами инсерций мобильных элементов и экспрессии генов в стрессовых условиях и (3) отбор гомозиготных растений трансформантов, несущих ген белка GAG активного транспозона EVD слитого с эпитопом 3xflag (evdGAG-FLAG и FLAG-evdGAG), и создание генетических конструкций для получения трансгенных растений экспрессирующих «доместицированный» белок GAG (Crtg10) слитый с эпитопом 3xflag (Crtg10-FLAG и FLAG-Crtg10). Для изучения динамики мобилома растений в стрессовых условиях нами было проведено выделение внехромосомных кольцевых ДНК, маркеров мобилома, из растений арабидопсиса, подвергнутых различным стрессам: тепловой стресс (HS), обработка флагеллином (Flg) и обработка абсцизовой кислотой (ABA). Было проведено нанопоровое секвенирование вкДНК и показано, что состав мобилома значительно не меняется при воздействии ABA и Flg. В тоже время, тепловой стресс индуцирует существенные изменения в составе мобилома. При этом активируется ретротранспозоны семейства ONSEN, которые генерируют вкДНК и образуют, которые неравномерно локализуются в геноме A.thaliana. Для изучения динамики мобилома на уровне структуры кольцевых ДНК по данным нанопорового секвенирования нами был впервые разработан пайплайн (https://github.com/Kirovez/eccStructONT). Проведённый анализ впервые показал, что мобильные элементы EVD и ONSEN в условиях теплового стресса у ddm1 генерируют различные по структуре вкДНК, включая полноразмерные и усечённые вкДНК. ВкДНК ONSEN в большей степени чем вкДНК EVD представлены усечёнными молекулами, которые соответствуют LTR последовательностям. Изучение вкДНК у растений дикого типа, подвергнутых тепловому стрессу, показало, что мобильные элементы ONSEN генерируют преимущественно усечённые вкДНК. Таким образом, мы впервые показали, что не только количество, но композиция мобилома на уровне вкДНК существенно меняется под действием теплового стресса и может отличаться у растений дикого типа и мутантов арабидопсиса по генам, вовлечённым в метилирование ДНК. Для выявления связи между локализации инсерций мобильных элементов в разных стрессовых условиях с транскрипционно-активными регионами был проведён RNAseq анализ и анализ новых инсерций транспозонов. RNAseq анализ выявил несколько тысяч генов с повышенной и пониженной экспрессией на 8, 16 и 24 час после начала теплового стресса. Был проведён интегрированный анализ новых инсерций транспозонов семейства ONSEN и генов, со значительными изменениями экспрессии в условиях теплового стресса. Полученные результаты впервые показывают, что гены с пониженной экспрессией в условиях теплового стресса имеют значительно больше шансов, приобрести инсерции ONSEN, чем гена с повышенной экспрессией. Такая необычная картина может быть объяснена вытеснением гистона H2A.Z, главной мишени для ONSEN, у генов с повышенной экспрессией в условиях теплового стресса в следствии связывания с транскрипционным фактором HSFA1. Наши исследования впервые демонстрируют, что паттерн экспрессии генов в стрессовых условиях может влиять на вероятность приобретения ими инсерций транспозонов.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В отчётный период продолжились исследования по созданию популяции растений арабидопсиса с новыми инсерциями эндогенных мобильных элементов для изучения последствий новых инсерций на эпигенетическом и транскриптомном уровнях. Для индукции активности мобильных элементов и их наследования был использован комбинированный стресс, включающий воздействие веществ, снижающих некоторые типы метилирования ДНК, и одного из стрессов для активации транскрипции ретротранспозонов. При тестировании разных типов стрессов (тепловой стресс, флагелин, азотное голодание, абсцизовая кислота) было обнаружено, что только тепловой стресс (37С) в комбинации с эпигенетическим стрессом вызывают активацию LTR ретротранспозонов (Merkulov et al., 2023; https://doi.org/10.3390/plants12112178). Используя такую комбинацию стрессов, в проекте была создана популяция растений, с которой уже было собрано более 2000 семян, а после зрелости всех растений будет собрано не менее 15000 семян. Семена М2, полученные от индивидуальных растений М1 были высеяны в количестве 100 штук, что позволило получить 52 жизнеспособных растения. Эти растения были проверены на наличие новых унаследованных инсерций разными методами, включая ПЦР в реальном времени, транспозонный дисплей и полногеномное секвенирование 15 растений. Первые два метода выявили растения со значительным превышением числа копий ретротранспозона ONSEN в геноме. На основе этих результатов из 50 растений были отобраны 15 растений для полногеномного нанопорового секвенирования индивидуальных растений на платформе PromethION. Было проведено полногеномное секвенирование 15 растений М2 и получены данные, соответствующие 2 - 7х кратному покрытию генома арабидопсиса, что достаточно для обнаружения большинства инсерций в геноме. Результаты секвенирования показали, что нам удалось добиться активации транспозонов ONSEN и, что самое важное, наследование новых инсерций. Идентифицированы инсерции ONSEN в 13 из 15 растений. В используемых растениях число инсерций варьировало от 1 до 28. Некоторые из инсерций были валидированы с помощью ПЦР и получено подтверждение наличия инсерций в ожидаемых растениях (по данным секвенирования). Стоит отметить, что более 90% всех инсерций локализованы в аннотированных генах арабидопсиса, что очень важно для следующего этапа проекта и в целом для использования созданной популяции для функциональной геномики. Таким образом, в этой части проекта нами успешно получены растения с новыми инсерциями ретротранспозонов. На третьем этапе проекта, полученные растения будут использованы для ответа на вопрос о влиянии новых инсерций на ДНК метилирование и на транскрипцию в месте инсерции. Вторая часть проекта посвящена изучению "одомашненного" белка GAG ретротранспозона, недавно обнаруженного в геноме арабидопсиса (ген Ctrg10 или dGAG). Для функциональной характеристики Ctrg10 на втором этапе проекта нами созданы линии растений арабидопсиса со сверхэкспрессией этого белка. Данные линии были получены после трансформация A. thaliana методом “floral dip” с помощью штаммов A. tumefaciens, несущих конструкции для экспрессии Ctrg10, тагированного эпитопом 3xFLAG на С- конце, и проведен отбор и первичный скрининг растений-трансформантов T1. После оценки экспрессии и Вестерн блоттинга были отобраны 3 растения Т1 с доказанной экспрессией и трансляцией Crtg10-FLAG для последующих экспериментов. Для выявления потенциальных молекул РНК/ДНК, взаимодействующих с Ctrg10, на данном этапе проекта была проведена оптимизация протокола РНК-иммунопреципитации на растениях, экспрессирующих GAG-FLAG и мутантных по гену ddm1. Адаптированный протокол позволил успешно провести иммунопреципитацию целевого белка GAG-FLAG из растений ddm2.