КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-10059

НазваниеНуклеосомы-зонды как инструмент поиска новых регуляторов системы эксцизионной репарации оснований ДНК

РуководительКутузов Михаил Михайлович, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2022 - 06.2025

Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словануклеосомы, хроматин, система эксцизионной репарации оснований, аффинная модификация, FRET, мишени для терапии

Код ГРНТИ31.27.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Предлагаемый проект посвящен выявлению и изучению белков, способных взаимодействовать с нуклеосомами, содержащими в своей структуре ДНК-интермедиаты системы эксцизионной репарации оснований. Такой подход позволит частично учесть влияние организации хроматина на функционирование системы BER. Кроме того, идентификация белков, оказывающих влияние на эффективность системы BER на нуклеосоме, позволит выявить ранее неизвестные регуляторные факторы этой системы репарации. Известно, что нуклеосомная организация сама по себе, а также возможность перестройки структуры хроматина, влияют на эффективность работы большинства ферментов системы BER. Функционирование некоторых негистоновых белков хроматина может дополнительно оказывать влияние на изменение степени компактизации ДНК и, как следствие, на спектр белков, взаимодействующих с нуклеосомным зондом. Фракционирование экстрактов ядер клеток с целью их обогащения по белкам, взаимодействующим с хроматином, позволит выявить минорные белок-нуклеиновые контакты. Выполнение проекта основывается на применении аффинной модификации с использованием нуклеосом-зондов, реконструированных на основе ДНК с реакционноспособными группами. В качестве реакционноспособных групп будут использованы АР-сайты и/или комбинация повреждения ДНК и фотоактивируемой группы. Ранее в нашей лаборатории были отработаны подходы по использованию ДНК-зондов с такими группами для идентификации белков, взаимодействующих с повреждениями, имитирующими интермедиаты BER. В качестве основного метода при идентификации продуктов аффинной модификации будет использован метод MALDI-TOF-MS. Высокие показатели чувствительности и специфичности этого метода позволяют идентифицировать продукт «пришивки», содержащийся в низкой концентрации и/или в составе сложной смеси, например, среди других компонентов экстракта клеток. Оригинальность работы заключается в применении нуклеосомных частиц в качестве зондов, а также в использовании фракционированных экстрактов ядер культур клеток человека для поиска регуляторных белков системы репарации. Выполнение предлагаемого проекта позволит углубить понимание регуляции процесса BER на нуклеосомах, что представляет как фундаментальный, так и практический интерес для поиска ингибиторов систем репарации, потенциальных антираковых препаратов.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта предполагается получить результаты, имеющие как фундаментальное, так и прикладное значение. Будет разработан набор нуклеосомных конструкций - зондов для выявления белков, взаимодействующих с субстратами такого типа в экстрактах ядер клеток человека. Будет отработана методика для идентификации белков, взаимодействующих с указанными зондами. Будет получена информация о спектре белков, взаимодействующих с модельными нуклеосомами-зондами, в составе экстрактов ядер клеток. Будут выявлены белки, являющиеся потенциальными регуляторами системы BER для дальнейшего исследования их функций. Научная значимость результатов, которые будут получены в ходе выполнения предлагаемого проекта, заключается в углублении понимания механизмов регуляции процессов репарации ДНК. Будут выявлены новые факторы и пути регуляции эффективности системы BER. Таким образом, будет создана более целостная картина координации системы BER в условиях, приближенных к физиологическим, поскольку в качестве инструмента поиска будут использованы компактизованные формы ДНК - нуклеосомы.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Системы репарации ДНК играют важную роль в обеспечении целостности генома. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой теме, она до сих пор остается предметом большого научного и прикладного интереса. Основные стадии процессов репарации ДНК, в том числе эксцизионной репарации оснований ДНК (BER), детально охарактеризованы [Jackson & Bartek, Nature, 2009; Hosoya & Miyagawa, Cancer Sci, 2014]. В настоящее же время наибольший интерес представляет изучение механизмов регуляции этих систем [Kumar et al, Nucleic Acids Res, 2020, Belousova et al, Sci Rep, 2018; Zarkovic et al, Nucleic Acids Res, 2018; Lavrik, DNA repair, 2020]. Примечательно, что нуклеосомную организацию ДНК саму по себе можно рассматривать как способ регулирования эффективности протекания ДНК-зависимых процессов, включая репарацию. Известно, что большинство стадий процесса BER протекают с меньшей эффективностью при компактизации ДНК в нуклеосомную частицу [Jagannathan et al, Chrom Res, 2006]. Степень доступности нуклеотидов для взаимодействия с ферментами репарации во многом зависит как от положения нуклеотида относительно диады нуклеосомы, так и от его пространственной ориентации относительно гистонового кора [Beard et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2003; Hinz et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2010; Caffrey & Delaney, Mutagenesis, 2020]. Недавнее открытие фактора PARилирования гистонов – белка HPF1, обнаружило новые возможные пути в регуляции нуклеосомной организации за счет специфического PARилирования коровых гистонов [Suskiewicz et al, Nature, 2020]. Использование модельных нуклеосом-зондов при изучении ДНК-ассоциированных биологических процессов является информативным подходом, поскольку позволяет выявлять новые белки-партнеры, взаимодействующие непосредственно с зондами [Khodyreva & Lavrik, DNA repair, 2020]. В ходе выполнения работ в 2022 - 2023 году сконструированы и наработаны ДНК-субстраты, являющиеся интермедиатами BER. Дизайн модельных зондов производили с учетом особенностей структуры нуклеосомы таким образом, чтобы повысить эффективность пришивки белков к реакционноспособной группе ДНК и минимизировать вклад неспецифических модификаций гистонов. Проведено реконструирование нуклеосом с использованием исходной dU-содержащей ДНК, подобраны условия ферментативной обработки нуклеосомных частиц для получения зондов с активной группой. Подобраны условия для проведения аффинной модификации компонентов экстрактов ядер клеток HEK 293 модельными нуклеосомами-зондами. Предварительные эксперименты указывают на наличие различий в спектрах модифицированных белков, полученных с использованием АР-содержащих ДНК и нуклеосом. Одномолекулярные методы исследований, такие как атомно-силовая микроскопия являются информативным инструментом для изучения белок-нуклеиновых комплексов, что особенно актуально при изучении взаимодействий регуляторных белков с их мишенью. Для отработки подхода по изучению влияния белков, потенциально регулирующих работу репарационных систем опосредованно через регуляцию компактизации нуклеосом, мы исследовали влияние белков PARP1, PARP2 и PARP3 на изменение геометрических характеристик нуклеосом этим методом. Мы показали, что, вопреки ожиданиям, все три белка преимущественно связываются с коровой частью нуклеосом. Впервые показано, что PARP3 значимо «уплотняет» и стабилизирует структуру нуклеосной частицы. Такое влияние может иметь значение для регуляции степени компактизации генома на нуклеосомном уровне.

Публикации