КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-10088

НазваниеОбратимое фосфорилирование белков тилакоидных мембран как мишень для повышения устойчивости высших растений к факторам среды

РуководительВетошкина Дарья Васильевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Московская обл

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2025 

Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-206 - Физиология и биохимия растений

Ключевые словафотосинтез, адаптация, устойчивость, высшие растения, обратимое фосфорилирование белков, светособирающая антенна, фотосистема 1, фотосистема 2

Код ГРНТИ34.31.17

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Обратимое фосфорилирование белков светособирающего комплекса фотосистемы 2 (ССК2) играет важную роль в адаптации растений к условиям освещения – ключевого фактора для функционирования фотосинтезирующих организмов; реакции фосфорилирования/дефосфорилирования при этом осуществляют фермент киназа STN7 и фосфатаза TAP38/PPH1, соответственно. Фосфорилирование белков Lhcb1 и Lhcb2 ССК2 приводит к отстыковке периферической части ССК2, содержащей эти белки, от фотосистемы 2 и связыванию ССК2 с фотосистемой 1, что балансирует таким образом работу обеих фотосистем. Данный защитный механизм представляет собой краткосрочную адаптацию фотосинтетического аппарата и запускается при переходе от ночного к дневному периоду или изменении спектрального состава света и называется в англоязычной литературе state transitions, т.е. переходы состояний. Максимальное развитие данного процесса, как показано, происходит после 20-ти минут освещения. Долгосрочная адаптация на уровне ССК2 в ответ на изменение уровня освещенности заключается в изменении размера ССК2, в частности, при повышенном освещении происходит уменьшение размера этой антенны путем прекращения биосинтеза белков Lhcb1, Lhcb2, Lhcb3 и Lhcb6, что способствует защите фотосистемы 2 от фотоингибирования. Данный тип адаптации запускается при более длительном действии света, от 1-го до нескольких дней. Ключевую роль в обеих адаптациях, как было показано, играет фермент STN7 киназа, при этом одним из необходимых условий для работы киназы является наличие АТФ в хлоропласте. Сложившаяся к настоящему времени картина выглядит парадоксальной: фосфорилирование белков Lhcb1 и Lhcb2 и сам процесс state transitions происходят только в условиях низкой освещенности, но не в условиях повышенной освещенности, когда АТФ в хлоропласте накапливается в значительном количестве, что является благоприятным условием для протекания state transitions. Ингибирование процесса state transitions при высокой интенсивности света наводит на мысль о другом механизме участия фермента STN7 киназы в долгосрочной адаптации, не связанном со state transitions, и о возможном ее включении в сигнальные пути в этих условиях. Кроме того, уровень фосфорилированных белков зависит не только от функционирования киназы, но и от функционирования фосфатазы TAP38/PPH1. Однако до сих пор не установлены факторы, влияющие на активность фосфатазы TAP38/PPH1, участвующей в дефосфорилировании белков антенны фотосистемы 2, и не изучена роль этой фосфатазы на ярком свету. Научной проблемой, на решение которой направлен данный проект, является исследование взаимосвязи краткосрочной и долгосрочной адаптации фотосинтетического аппарата к измененным условиям освещенности. Основной научной идеей проекта является интеграция обратимого фосфорилирования белков ССК2 в кратковременную и долговременную адаптацию к действию света. Более того, литературные и наши данные показывают, что STN7 киназа может являться ферментом, активность которого обеспечивает не только адаптацию растений к действию света, но и к другим факторам среды, а именно к изменению концентрации диоксида углерода в воздухе. В связи с этим, в ходе реализации проекта будет также изучена роль обратимого фосфорилирования при адаптации растений к изменению содержания углекислого газа, как другого основополагающего фактора роста и развития растений, что особенно актуально в связи с климатическими изменениями, наблюдаемы в современном мире. В наших предыдущих работах установлено, что для запуска уменьшения размера антенны фотосистемы 2 при повышении освещенности необходимым компонентом сигнальных путей является пероксид водорода – ключевой сигнальный агент при адаптации растений к различным факторам среды. В ходе реализации проекта предстоит выяснить как пероксид водорода влияет на обратимое фосфорилирование белков антенны фотосистемы 2 и на активность ферментов, участвующих в этом процессе. Для детальной оценки влияния пероксида водорода на функциональную активность STN7 киназы и TAP38/PPH1 фосфатазы, эти ферменты будут выделены и очищены после их гетерологической экспрессии в E. сoli и будет измерена их каталитическая активность при добавке пероксида водорода. Учитывая тот факт, что не только пероксид водорода может влиять на активность ферментов, будет изучено влияние действия других активных форм кислорода (АФК), таких как супероксидный анион радикал и гидроксильный радикал. Кроме того, необходимо установить, к каким изменениям влияние пероксида водорода или других АФК на тот или иной фермент будет приводить на уровне хлоропластного генома, для чего будут проведены исследования изменений, происходящих в пластоме в изучаемых условиях. Остаётся неизвестным влияние ассоциации фосфорилированных белков светособирающей антенны с фотосистемой 1 на функционирование реакционного центра фотосистемы 1. В литературе нет данных о влиянии фосфорилированных белков на продукцию АФК в фотосистеме 1, однако накапливается информация о важности фосфорилированных белков для защиты фотосистемы 1 от фотоингибирования. В ходе выполнения проекта будут изучены детальные механизмы того, как изменяется функционирование и устойчивость ФС1 в оптимальных и ингибирующих условиях. Исследование представляет собой решение ряда задач, направленных на установление: 1) роли фосфорилированных белков ССК2 в долгосрочной адаптации высших растений к повышенной освещенности; 2) зависимости между количеством пероксида водорода и обратимым фосфорилированием белков ССК2 и процессом state transitions в целом; 3) прямого влияния пероксида водорода и других АФК на функционирование выделенных и очищенных STN7 киназы и TAP38/PPH1 фосфатазы in vitro; 4) роли ассоциации ССК2, содержащего фосфорилированные белки, с фотосистемой 1, в регуляции образования пероксида водорода и других АФК, функционировании фотосистемы 1 и фотосинтетического аппарата в изучаемых условиях; 5) роли обратимого фосфорилирования в адаптации растений к измененному содержанию углекислого газа в воздухе и взаимосвязи между функционированием STN7 киназы, TAP38/PPH1 фосфатазы и уровнем содержания пероксида водорода в этих условиях; 6) влияния повышенной освещенности, приводящей к ингибированию фосфорилирования белков ССК2, на функционирование АТФ-синтазы, образующей субстрат для фосфорилирования белков – АТФ. Таким образом, выполнение данного проекта необходимо для того, чтобы понять, как осуществляются естественные адаптационные перестройки фотосинтетического аппарата при действии факторов среды, что является необходимым шагом для дальнейшего развития стратегии повышения устойчивости организмов.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения данного проекта существующая схема механизма адаптации высших растений к изменению освещенности будет дополнена, а именно будет определена взаимосвязь между кратковременной и долговременной адаптацией, а также выяснена роль фосфорилированных белков внешней светособирающей антенны фотосистемы 2, киназы STN7, фосфатазы TAP38/PPH1 и пероксида водорода в обоих типах адаптации. Будут выявлены отличия в адаптационном ответе к повышенной освещенности растений арабидопсиса дикого типа и растений или без киназы STN7, или без фосфатазы TAP38/PPH1. Будет охарактеризована роль фосфорилированных белков светособирающей антенны, ассоциированных с фотосистемой 1, в продукции АФК кофакторами ФС1, в развитии процессов фотоингибирования электрон-транспортной цепи в целом и фотосистемы 1, в частности. Впервые будет показана роль пероксида водорода в обратимом фосфорилировании белков светособирающей антенны ФС2. Более того, впервые с использованием изолированных белков – STN7 киназы и/или TAP38/PPH1 фосфатазы, будет показано существует ли прямое влияние пероксида водорода на функционирование данных ферментов in vitro. Таким образом, планируется не только показать существует ли влияние пероксида на обратимое фосфорилирование белков светособирающей антенны ФС2, но и выяснить мишень, на которую воздействует пероксид водорода, приводя к изменению фосфорилирования белков. Исследование изменений, происходящих в пластоме растений при изменении освещенности, позволит обнаружить гены, экспрессия которых имеет ключевое значение при адаптации к повышенной освещенности растений. Будут получены данные о взаимосвязи между уровнем содержания фосфорилированных белков ССК2 при повышенной освещенности и активностью АТФ-синтазы. Впервые будут получены данные о роли обратимого фосфорилирования в адаптации растений к измененному содержанию углекислого газа в воздухе. Эти результаты позволят решить сложившиеся к настоящему времени в мировом научном сообществе парадоксы и противоречия и позволят выработать оптимальную стратегию повышения устойчивости и продуктивности сельскохозяйственных культур, основанную на заложенных природой механизмах тонкой подстройки работы фотосинтетического аппарата растений в условиях изменяющейся освещенности.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Растения в ходе своей жизнедеятельности постоянно сталкиваются с изменениями в условиях окружающей среды. В отличие от животных растения не могут избегать неблагоприятные факторы среды, что и привело к формированию в растительных клетках большого количества адаптационных механизмов. Одним из наиболее часто меняющихся факторов, ключевым для жизни растений, является освещенность. При изменении освещенности растений оптимизация фотосинтетической активности происходит на разных уровнях организации растительной клетки и в разном временном диапазоне. Регуляция поглощения квантов света может происходить за счет изменений в структурно-функциональных характеристиках светособирающих антенных комплексов фотосистем. Механизм краткосрочной адаптации, state transitions, запускается в первые минуты освещения, а механизм долгосрочной адаптации включается при длительном воздействии измененной освещенности, более трех дней. Процесс state transitions заключается в миграции внешней части светособирающей антенны фотосистемы 2 (ФС2) между ФС2 и фотосистемой 1 (ФС1), что приводит к перераспределению поглощения световой энергии фотосистемами. При долгосрочной адаптации к условиям повышенной освещенности происходит подавление биосинтеза периферических белков антенны и, как следствие, уменьшение размера антенны ФС2, что приводит к уменьшению количества поглощаемых квантов света и позволяет избежать фотоингибирования, оптимизируя работу фотосинтетического аппарата. При этом, при повышенной освещенности происходит ингибирование процесса state transitions, т.е. краткосрочного адаптационного ответа. Однако являются ли процессы краткосрочной и долгосрочной адаптации взаимосвязанными и какова молекулярная природа сигналов для регуляции этих процессов долгое время оставалось невыясненным. В данной работе впервые было показано, что ингибирование state transitions происходит не только при повышении освещенности, но и при уменьшении концентрации углекислого газа в воздухе, что говорит об универсальности этого ответа на изменения в условиях окружающей среды. Известно, что повышение освещенности, как и действие других стрессовых факторов, приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) в растительных клетках, причем увеличение образования АФК происходит в основном за счет возрастания их продукции в хлоропластах. Ранее нами было показано, что именно пероксид водорода является сигналом, запускающим регуляцию размера светособирающей антенны ФС2 при длительной повышенной освещенности. В ходе данной работы было исследовано влияние пероксида водорода на процесс state transitions в листьях высших растений. Первым этапом процесса state transitions является активация фермента STN7 киназа, который осуществляет фосфорилирование белков светособирающей антенны ФС2 – Lhcb1 и Lhcb2. Накопление данных белков в фосфорилированной форме приводит к их отталкиванию от ФС2, к миграции антенных комплексов, содержащих эти белки, и их присоединению к ФС1. Для исследования влияния пероксида водорода на активность STN7 киназы оценивали накопление фосфорилированных белков Lhcb1 и Lhcb2 в присутствии и отсутствие пероксида водорода в реакционной смеси при освещении. Объектом исследования были интактные тилакоиды, выделенные из листьев Arabidopsis thaliana. Оценку накопления фосфорилированных белков проводили с помощью вестерн-блот анализа. Было показано подавление светозависимого накопления фосфорилированных белков Lhcb1 и Lhcb2 при добавке 250 и 500 мкМ пероксида водорода. При обеих концентрациях пероксид водорода не оказывал влияния на скорость электронного транспорта в изолированных тилакоидах, а также на значения максимального и эффективного квантовых выходов ФС2. В тилакоидной мембране Arabidopsis thaliana обнаружена еще одна киназа - STN8, осуществляющая фосфорилирование белков коровой части ФС2, в частности белка D1. Максимальное накопление этих белков в фосфорилированной форме происходит на высоком свету, то есть в тех условиях, когда в хлоропластах происходит генерация пероксида водорода с высокой скоростью. В нашей работе показано, что добавка пероксида водорода на свету не приводит к уменьшению содержания фосфорилированного белка D1, что означает, что данная киназа не ингибируется пероксидом водорода. Таким образом, в работе впервые показано ингибирование процесса state transitions пероксидом водорода. Возрастание количества пероксида водорода при действии различных стрессовых факторов препятствует переходу светособирающих комплексов от ФС2 к ФС1, что может быть необходимо для их протеолиза и уменьшения размера светособирающей антенны ФС2, учитывая предполагаемую в литературе локализацию протеазы вблизи ФС2. Данное предположение подтверждается результатами, полученными в данной работе, о неспособности растений с высоким содержанием фосфорилированных белков Lhcb1 и Lhcb2 (растения с заблокированным синтезом TAP38/PPH1 фосфатазы) адаптироваться к условиям повышенной освещенности по тому же механизму, как адаптируются растения арабидопсиса дикого типа.

 

Публикации

1. Надеева Е.М., Игнатова Л.К., Руденко Н.Н., Ветошкина Д.В., Найдов И.А., Козулева М.А., Иванов Б.Н. Features of Photosynthesis in Arabidopsis thaliana Plants with Knocked out Gene of Alpha Carbonic Anhydrase 2 Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 12(9), 1763 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/plants12091763