Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках первого года реализации проекта выполнена работа по трем направлениям, включающим исследование L-аспарагиназы из гипертермофильной археи Thermococcus sibiricus с помощью биоинформатических сервисов, инженерия и структурно-функциональное изучение фермента дикого типа. По первому направлению: - методом гомологичного моделирования на основе 3D структуры термо-аспарагиназы из Thermococcus kodakarensis получена пространственная модель изучаемого фермента, - выполнен дизайн мутантных форм TsA на основе анализа опубликованных данных по воздействию на термостабильность и термоактивность термо-L-АСП в сочетании с компьютерным моделированием. Используя подход, основанный на сравнении первичных последовательностей и пространственных структур термофильных и мезофильных L-АСП, выявлены различия в организации С-концевых участков между мезофильными и термо-АСП, включая TsA, а также замены ключевых аминокислот в субстрат-связывающей области ферментов, эволюционно адаптированных к работе в различных диапазонах температур. Для повышения ферментативной активности TsA предложено восстановить мезофильноподобную комбинацию GSQ в субстрат-связывающей области TsA; провести мутации, затрагивающие аминокислотные остатки С-концевой области, с целью повышения подвижности крышки, закрывающей активный центр гипертермофильного фермента. В рамках второго направления, связанного с получением улучшенных мутантных форм TsA, на базе ранее полученного вектора pMЕ2020 создана серия из 8 конструкций, содержащих 12 точеных мутаций и 1 делецию. Трансформацией E. coli BL21(DE3) сконструированными векторами получено 8 рекомбинантных штаммов. По направлению, связанному со структурными исследованиями фермента дикого типа TsA: - в рамках подготовительного этапа к кристаллографическим исследованиям проведена экспрессия, хроматографическая очистка белка, обнаружена способность фермента образовывать димеры за счёт дисульфидных связей между цистеинами двух соседних мономеров в условиях денатурирующего гель-электрофореза. Выявлено, что добавление бета-меркаптоэтанола, ДТТ нарушает образование димеров белка, при этом присутствие ДТТ не оказывает влияния на активность фермента. При молекулярном моделировании пространственной структуры TsA установлено, что вероятность образования функциональных димеров дисульфидными связями низка, ввиду больших расстояний между цистеинами двух соседних мономеров. В ходе ВЭЖХ-масс-спектрометрического исследования цельного белка в образцах без бета-меркаптоэтанола и в присутствии бета-меркаптоэтанола установлено, что в растворе присутствует только мономерная форма TsA без -S-S- димеров. Таким образом, в серии экспериментов показано, что димер белка TsA, образованный дисульфидными связями, не влияет на каталитическую активность фермента, поскольку отсутствует в растворе. Присутствие в растворе только мономерной формы TsA, согласно полученным результатам, позволило перейти к этапу подготовки образца TsA для кристаллографии. Очищенный препарат сконцентрирован и переведен в буфер для кристаллизации, финальная концентрация белка составила 11.5 мг/мл; - изучена вторичная структура TsA и структурные изменения, наблюдаемые в условиях термоинактивации. Содержание вторичных структур для TsA составило: α-спирали – 35.6 %, антипараллельные β-листы – 7.5 %, параллельные β-листы – 8.4 %, β-повороты – 16.2 %, рандомные структуры – 32.2 %., При термоинактивации выявлены значительные изменения во вторичной структуре фермента: уменьшение процентного содержания α-спиралей, рост процента β-структур и неупорядоченных структур. Определены параметры конформационной стабильности TsA (температура плавления и термодинамические параметры фазового перехода). При изучении изменений в третичной структуре при повышении температуры методом флуоресцентной спектроскопии выявлено, что гипертермофильному ферменту для проявления высокой активности необходим переход в более развернутую конформацию, которая достигается при температурах свыше 80 °C. Полученные в течение первого года результаты являются базисом для последующих исследований экстремофильной L-АСП, запланированных в рамках проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В течение второго года реализации проекта проведены исследования различных форм гипертермофильной L-аспарагиназы их археи Thermococcus sibiricus (TsA), полученных с помощью 2 подходов – белковой инженерии и конъюгирования с полимерами различного состава. В рамках структурно-функционального изучения получено 10 мутантных форм фермента, проведена их экспрессия в клетках Escherichia coli. По результатам экспресс-скрининга ферментативной активности неочищенных экстрактов при 24-90°C для дальнейшего изучения отобрано 6 наиболее активных форм, для которых была проведена очистка. В сравнительных исследованиях физико-химических и кинетических характеристик 6 мутантных вариантов установлено: - снижение температурного оптимума с 60 до 90 °C для 4 мутантных форм (TsA∆7, TsA22, TsA24, TsA112), сохранение максимальной активности при 90 °C аналогично ферменту дикого типа для 2 вариантов TsA (TsA293, TsA_gsq), - ~ 2-кратный рост активности в сравнении с ферментом дикого типа у TsA24, TsA112. TsA293, TsA_gsq при 37 °C; TsA293 и TsA_gsq при 90 °C; - влияние мутаций на субстратную специфичность TsA. Отсутствие нежелательной L-глутаминазной активности обнаружено у TsA22, TsA112, TsA293 (для фермента дикого ~ 5-7% от L-аспарагиназной активности). D-аспарагиназная активность не обнаруживалась у TsA24, TsA112, TsA293 (62.2% от L-аспарагиназной для TsAwt). D-аспарагиназная активность для TsA∆7и TsA_gsq составила 14.5 и 21.3% соответственно, TsA22– 84.8%; - наибольшая каталитическая эффективность среди мутантных форм обнаружена у TsA22, TsA293, TsA_gsq; - при достаточно высокой термостабильности мутантных форм, за исключением TsA∆7, фермент дикого типа превосходил по этому показателю мутантные варианты. Повышенная жесткость структуры гипертермофильных ферментов коррелирует с их высокой термостабильностью. С целью повышения каталитической активности TsA проведенные мутации были направлены на повышение конформационной гибкости и снятие «избыточных» взаимодействий, стабилизирующих жесткую структуру фермента, что привело к снижению термостабильности. При этом влияние мутаций на активность было разнонаправленным. Делеция участка Lys277-Val280, направленная на облегчение движения крышки, привела к снижению активности фермента более чем на 80 %. Сопоставление структурных и экспериментальных данных показало, что Tyr278, не являясь консервативным для L-аспарагиназ I и II типа, в гипертермофильной L-аспарагиназе взаимодействует с каталитическим Thr12. Делеция Lys277-Val280 привела к нарушению контактов данного участка с крышкой и консервативными а.о., снизив активность фермента. В то же время разрушение сети водородных связей путем замены консервативного среди термо-аспарагиназ Thr56 на Gln, расположенный в соответствующей позиции EcАll, с одновременной заменой Asp54 на Gly для сохранения архитектуры активного центра, восстановило мезофильно-подобную комбинацию GSQ, включающую субстрат-связывающий Ser55. Совместная замена Asp54Gly/Thr56Gln привела к 2-кратному росту активности фермента, благодаря облегчению конформационных изменений при связывании с субстратом. Согласно структурным данным, высокое сходство гипертермофильных L-аспарагиназ в общей пространственной топологии, структуре активного центра и ряде некаталитических участков, в которых проведены замены консервативных для термо-аспарагиназ а.о., позволяет прогнозировать аналогичный эффект данных мутаций на свойства гипертермофильных L-аспарагиназ Thermococcus sp., Pyrococcus sp. На основании сравнительного анализа характеристик полученных мутантных форм TsA 5 вариантов выбраны для дальнейших исследований: TsA22 (сниженный до 60°С температурный оптимум, отсутствует глутаминазная активность); TsA24 (температурный оптимум 60°С, при 37 °С превосходит по активности фермент дикого типа); TsA_gsq (температурный оптимум 90°С, превосходит по активности фермент дикого типа в диапазоне температур 37-100°C); TsA112 (температурный оптимум 60°С, при 37 °С превосходит по активности фермент дикого типа, отсутствует глутаминазная активность); TsA293 (температурный оптимум 90°С, превосходит по активности фермент дикого типа в диапазоне температур 37-90°C, отсутствует глутаминазная активность). В рамках направления, связанного с модификацией гипертермофильной L-аспарагиназы TsAwt посредством конъюгирования с полимерами различного состава, получены препараты TsAwt-полиэтиленгликоль (ПЭГ), TsAwt-полиэтиленимин (ПЭИ), TsAwt-спермин (СП). Проведено сравнительное изучение влияния данных полимеров на основные характеристики фермента дикого типа. Выявлено, что конъюгирование с полиаминами (ПЭИ, СП) и полиэтиленгликолем (ПЭГ) не оказывает влияния на вторичную структуру фермента. При этом ПЭГ может способствовать стабилизации димера TsAwt. Установлено, что температурный оптимум конъюгированных форм TsAwt снижен ~ на 10 °C до 80-85 °С. При 80 °С TsAwt-СП превосходил по активности TsAwt. Для TsAwt-ПЭГ наблюдалось изменение механизма термоинактивации и отсутствие агрегации, наблюдаемой для нативного фермента. Сравнительное изучение эффектов полученных форм TsA будет продолжено на следующем этапе проекта.