Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Создание и оптимизация клеточной модели ротавирусной инфекции. На первом этапе Проекта была проведена оптимизация клеточной модели ротавирусной инфекции с использованием культуры клеток почки макак-резусов MA-104 и ротавируса человека группы А, штамм Wa, генотип G1P[8] (Rotavirus A, ATCC-VR-2018). Работы проводились совместно со сторонней организацией на базе лаборатории прикладной вирусологии ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова - соисполнителя настоящего исследования. В результате выполненной работы на основе культуры клеток МА-104 и штамма Wa РВА отработана клеточная модель ротавирусной инфекции. В частности, отработаны условия количественного определения ротавирусной РНК, в образцах клеток, инфицированных вирусом через 8-72 часа, методом ОТ-ПЦР-РВ с использованием калибровочной кривой и праймеров к нетаргетному NSP3 гену РВА. Также отработана методика полуколичественной оценки вирусной репродукции по определения в зараженных клетках нетаргетного ротавирусного антигена VP6. Отработаны условия и калибровка определения инфекционной активности РВА методом ИФА выраженной в эквивалентах ТЦД50/мл в исследуемых образцах. 2. Эволюционный анализ последовательностей генов РВА. Дизайн и отбор таргетных последовательностей для РНК-интерференции. На первом этапе работы по проекту было проведено эволюционное и биоинформатическое исследование четырех генов ротавируса: VP4, VP7, NSP1 и NSP4 как потенциальных мишеней для РНК-интерференции в качестве противовирусной терапии. Нами были исследованы белок кодирующие области мРНК и аминокислотные последовательности генов. Всего было проанализировано 24 171 последовательностей, представленных в базе GenBank NCBI на февраль 2023 года. В анализ вошли последовательности штаммов ротавируса человека группы А, циркулировавшие с 1974 по 2022 гг. В отдельный блок анализа вошли последовательности штаммов, которые были выделенных на территории РФ, как наиболее значимые для стратегического развития. В результате анализа а.к. последовательностей выбранных генов были получены: кладограммы с апостериорными вероятностями для каждого расщепления и филограммы со средней длиной ветвей для каждого гена. Все деревья демонстрируют однозначное распределение циркулирующих штаммов по соответствующим клайдам, а также отражают разделение штаммов по регионам, в которых они выделены. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей VP4 и VP7, выявил сильную разнородность, встречающихся в популяции штаммов, циркулирующих с 2012 по 2022 год. Для генов неструктурных белков NSP1 и NSP4 характерна большая однородность по всем последовательностям. Однако встречаются неоднозначные, но малочисленные инделл-полиморфизмы. По данным эволюционного анализа нуклеотидных последовательной были получены консенсусные последовательности для поиска областей мишеней РНК-интерференции. Был проведен поиск участков с повышенной консервативностью и обладающих оптимальным нуклеотидным составом, прежде всего по соотношениюGC/AT. В результате были выявлены потенциальные области и проведен дизайн in silico 10 потенциальных противовирусных миРНК. 3. Скрининг вирусингибирующего потенциала подобранных миРНК Был осуществлён первичный скрининг вирусингибирующего действия разработанных миРНК таргетных в отношении ротавирусной инфекции in vitro. Препараты миРНК, доставляемые Lipofectamine RNAiMAX (концентрация миРНК 0,2 мкМ) вносили по профилактической схему за 24 часа до заражения, и в течении 3х суток оценивали репродукция вируса с определением титра вируса по ИФА и накоплению вирусной мРНК методом ОТ-ПЦР РВ. Полученные двумя методами данные свидетельствуют, что на определенных временных точках внесение подобранных миРНК приводит к подавлению репликации РВА in vitro. В частности, было показано однозначное и доставерное снижение вирусной репродукции более чем на 50% для двух миРНК таргетных к гену NSP4. Эти результаты позволяют отобрать ограниченное количество миРНК для последующих вирусологических экспериментов с наиболее эффективными разработанными трансфекционными носителями. 4. Синтез и характеризация гибридных микроносителей для инкапсуляции миРНК, различных по своим характеристикам: линейному размеру, композитному составу, поверхностной модификации. Оптимизирована процедура синтеза новых наноразмерных частиц CaCO3 (диаметр до 200 нм). В результате исследования была отработана методика получения нанокапсул СаСО3 с добавлением полиакриловой кислоты (ПА), наиболее подходящих, по нашему мнению, для внутриклеточной доставки противовирусных миРНК. Не модифицированные добавками частицы CaCO3 полученные стандартным синтезом представляют собой разнородные фракции слегка вытянутых квазисфероидов с линейными размерами 210-842 нм. Добавление ПА значительно сказалось на уменьшении размеров фракции наночастиц до 50- 500 нм. Выяснили, что концентрация ПА имеет решающее значение для контроля размера частиц и для сохранения размера 200-300 нм, концентрация ПА не превышает 50мг.мл. Также было исследовано время образования частиц и показано, что длительный синтез 60 минут приводит к образованию однородных сфероидальные частиц размером от 60 до 80 нм, не склонных к агрегации. Данный тип частиц планируется использовать для экспериментов по установлению вирусингибирующей активности in vitro и далее в экспериментах in vivo для пероральной доставки. 4.1. Оптимизация наночастиц по размеру для внутриклеточной доставки миРНК in vitro на клеточной линии Сасо2 Для дальнейших экспериментов по биораспределению in vivo при пероральном введении было синтезировано и охарактеризовано 4 типа потенциальных носителей в разных размерных диапазонах: 1) микрочастицы CaCO3 - 2-4 мкм 2) микрочастицы PLA (полилактид) – 2-10 мкм 3) наночастицы CaCO3 – 80-120 нм 4) наночастицы PLA – 80-120 нм Все капсульные носители были охарактеризованы двумя методами: сканирующей электронной микроскопии – СЭМ и методом динамического светорассеяния. И Микро- и наночастицы независимо от размера обладали сферической морфологией и пористой структурой, и способны к загрузке миРНК с флуоресцентной меткой. Все носители не продемонстрировали значимого цитотоксического эффекта в течении 24 часов после трансфекции. Трансфекционная активность носителей меченных Су5 на клеточной модели Сасо2 была оценена полуколичественно методами проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии. Накопление флуоресцентной метки в клетках через 24 часа после трансфекции происходит более чем для 70% клеток по всем носителям. Наилучшие результаты показывает система доставки НАНОчастицы PLA демонстрируя 100% клеточный аптейк, независимо от вносимой концентрации частиц. 4.2. Биораспределение носителей in vivo было исследовано методом ОФЭКТ с дополнительной ex vivo радиометрией органов. Было исследовано биорспределение носителей в течение 48 часов при пероральном введении мышам линии BALB/c. с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) и прямой радиометрии внутренних органов (через 48 часов. Носители микро и наночсастицы CaCO3, а также микро и наночастицы полилактида меченные радиоактивным изотопом 99mTc (уникальная методика Karpov et al., 2022) вводили мышам перорально в концентрации 5 мг/мл, в отрицательного качестве контроля вводился раствор чистого 99mTc в NaCl. Для всех носителей было выявлено характерное накопление радиоактивного сигнала в желудочно-кишечном тракте через 24 часа после перорального введения. Через 48 часов можно обнаружить радиоактивный сигнал во всех отделах ЖКТ. По данным биораспределения можно сделать вывод, что всасывание частиц в тонком кишечнике значительно уступает всасыванию в толстом кишечнике, однако превышает фоновый пороговый уровень. Перспективным носителем в экспериментах in vivo кажется использование микрочастиц PLA. Однако требуюется продолжение работы по исследованию пероральной доставки и биодистрибьюции носителей in vivo на следующем этапе проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Оценка потенциала вирусингибирующей активности препаратов миРНК в отношении ротавирусной инфекции в экспериментах на клеточных моделях. Проведено исследование на клеточной модели ротавирусной инфекции МА-104 вирусингибирующей активности препаратов миРНК с коммерческим носителем Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen) и нанокапсулами из полилактида (nPLA), отобранными в результате экспериментов по сравнительной внутриклеточной доставке in vitro и биодистрибьюции in vivo. Последовательности миРНК, используемых в экспериментах приведены в таблице 1 Приложения к данному отчету. Оценку вирусингибирующей активности препаратов миРНК с коммерческим носителем проводили по профилактической схеме введения за 24 часа до заражения ротавирусом (штамм Wa), в дозе заражения 2,75 lg ТЦД50/лунку (0,01 MOI). Результаты анализировали методами титрования, ИФА и ОТ-ПЦР-РВ через 8, 24, 48 и 72 часов после заражения. На первые сутки до 24 часов после инфекции прослеживается снижение титра вируса до уровня 30% для препарата Si7 (мишень ген NSP1). После 48 часов в лунках с препаратами Si1, Si2, Si5(мишени в гене NSP4) вирусный антиген определяется на уровне в 2-5 раз более низком, по сравнению с контрольной неспецифической Si8. Тенденция к снижению вирусного антигена для этих препаратов сохраняется также на 72 часа, однако о максимальном снижении титра можно говорить только для препарата Si1. Сопоставление результатов определения вирусного антигена, вирусной РНК и инфекционной активности вируса на разные сроки после заражения трансфицированных миРНК клеток показало выраженную противовирусную активность препарата миРНК Si7- на ранних сроках после инфицирования и препаратов Si1 и Si5 на более поздних сроках заражения. Данные препараты снижают титр вируса в клетках не менее, чем на 2,5 lg, что согласовывалось с данными определения ротавирусного антигена и вирусной РНК. Проведена оценка вирусингибрующей способности препаратов миРНК, упакованными в нанокапсулы PLA (далее nPLA) с добавлением по профилактической (за 24 часа до заражения) и лечебной (в момент заражения) схеме на клетках МА-104 с заражением ротавирусом (штамм Wa), в дозе заражения 2,75 lg ТЦД50/лунку (0,01 MOI). Продемонстрировано снижение титра вируса до уровня 50% для обеих схем введения препарата Si1 по сравнению с контрольной неспецифической Si8. Для терапевтической схемы введения препаратов не наблюдается значимого снижения вирусной репродукции в клетках, что может быть связано с недостаточной скоростью высвобождением миРНК. Также обнаружена тенденция к снижению вирусного антигена при введении препаратов носителей пустышек в обеих схемах введения. Дополнительно было определено, что заражение клеток способствует наибольшему проникновению частиц в клетки, что отражается в увеличении флуоресцентного сигнала и повышению эффективности трансфекции в 10 и более раз по сравнению с трансфекцией интактных клеток. Трансфекция в момент заражения, оцененная через 24 часа, также увеличивается минимум вдвое по оценке накопленного флуоресцентного сигнала. Однако сами по себе частицы-носители оказываются способны подавлять вирусную репродукцию в клетках, по видимости вследствие активации интерферонового ответа. 2. Была проведена оптимизация модельной люцеферазной системы для оценки эффективности РНК-интерференции для оценки эффективности различных носителей. В работе использовались клеточная линия CHO, стабильно экспрессирующая люцеферазный ген, клеточные линии Сасо-2 и MDCK, трансфицируемые коммерческой плазмидой pMax-Luc_FF (Promega) и полученной с нее методом инвитро-транскрипции мРНК. Для различных клеточных моделей были построены кривые затухания люцеферазной активности с течением времени и определены параметры для измерения люминесценции в клетках. Дополнительно было показано, что заражение вирусом гриппа типа А клеток МDCK трансфицированных мРНК люциферазы, не влияет значимо на экспрессию мРНК, и результаты измерения люцеферазной активности не превышают статистические погрешности. Таким образом, данная клеточная модель может быть использована для полуколичественной оценки эффективности РНК-интерференции для различных носителей. В результате биоинформатического анализа гена люциферазы светлячка было подобрано 4 потенциальных миРНК для РНК-интерференции, последовательности представлены в таблице 1 Приложения. Проведен скрининг миРНК доставляемых липидами DOTAP:DOPE в соотношении к миРНК 8:1 на клеточных линиях CHO_luc и Сасо2 ко-трансфицированной мРНК люциферазы. По совокупности данных показана наибольшая ингибирующая способность для миРНК siAF4, показано достоверное снижении интенсивности люминесценции по сравнению с контролем мРНК и негативной неспецифической миРНК более чем в 3 раза. Продемонстрировано значимое двухкратное снижение интенсивности люминесценции на клеточной модели. Сасо2 ко-трансфицированной мРНК люциферазы и siAF4 упакованной в nPLA (рисунок 13 Приложения). 3. Было проведено исследование на клеточной модели Сасо-2 внутриклеточного проникновения и динамики разработанных на первом этапе микро и нано капсул, содержащих флуоресцентно меченые красители в стенках и флуоресцентно-меченную миРНК внутри с использованием прижизненного pH-чувствительного маркера лизотрэкера - LysoTracker® Green DND-26 (Thermo Fisher Scientific) во временные точки 30 мин., 1, 4 и 24 часа после внесения носителей. По данным конфокальной микроскопии можно говорить об около мембранном проникновении всех видов носителей через час после трансфекции клеток; и полном проникновении в клетку через 24 часа. Для всех типов носителей в первый час не была обнаружена колоколизация с флуоресцентным красителем лизотрэкером. Колокализация микрокапсул СаСО3 с лизотрэкером детектирована в более чем 50% случаев через 4 часа после трансфекции. В совокупности с данными о более чем 90 процентном захвате носителей клетками через 24 часа после трансфекции можно сделать вывод о том, что носители, проникающие путем различного вида эндоцитоза, не попадают в лизосомы и не зачисляются сами, что приводит к высокому релизу миРНК в клетке без повреждения. 4. Исследование in vivo биораспределения нано- и микро капсул из полилактида и СаСО3 для доставки миРНК с пероральным введением. Для создания стабильных и эффективных носителей осуществляли модификацию разработанных на первом этапе капсульных частиц с применением катионного полимера поли-(аллаламин-гидрохлорид) - ПАХ. Было синтезировано и охарактеризовано методами сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии, методом динамического светорассеяния и определением ζ-потенциал 4 типа потенциальных носителей: микрочастицы CaCO3 - 2-4 мкм; микрочастицы PLA – 2-10 мкм; наночастицы CaCO3 – 80-300 нм; наночастицы PLA – 80-120 нм. Показано, что все типы носителей имеют высокую загрузочная способность миРНК и емкость загрузки может достигать 5 пикомоль/мкл и сохраняют стабильность при хранении и обработки носителей растворами, моделирующими среды ЖКТ. Также все носители не продемонстрировали значимого цитотоксического эффекта в течении 24 часов после трансфекции. Для всех носителей накопление флуоресцентной метки в клетках Сасо2, оцениваемое по данным проточной цитофлуориметрии, через 24 часа после трансфекции происходит с эффективностью более 70%. Наночастицы PLA, демонстрируют 100% клеточный аптейк, независимо от вносимой концентрации. Профиль биораспределения через 1 и 4 часа после перорального введения четырех типов частиц в экспериментах in vivo на мышах использовали: флуоресцентную визуализацию органов ЖКТ ex vivo, флуоресцентное гистологическое исследование срезов тканей ЖКТ, количественную оценку интенсивности флуоресценции, однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ) с последующей прямой радиометрией извлеченных органов ЖКТ. Продемонстрировано влияние физико-химических свойств частиц на профиль биораспределения. Все носители аккумулируют в тканях органов ЖКТ уже через 1 ч после введения. Микрокапсулы накапливаются в большей мере в тканях желудка. Нанокапсулы PLA имеют наибольшую степень ассоциации с тканями тонкого кишечника, нано СаСО3, обладают наименьшей способностью к всасыванию и наибольшей скоростью выведения, через 1ч они аккумулируются в толстом кишечнике, а через 4 часа их уровень значительным образом снижается. При введении перорально капсул, нагруженных миРНК, морфологических патологических изменений тканей и цитотоксического действия препаратов не наблюдалось. Полученные конфокальные изображения срезов тканей с локализацией в них концентрированных сигналах флуоресцентно-меченой миРНК свидетельствует о внутриклеточной доставке миРНК в капсулах.