Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За последние годы накопилось множество экспериментальных свидетельств об участии стареющих/сенесцентных клеток в прогрессии патологий самой различной этиологии. Наш интерес лежит в области изучения клеточного старения в контексте заболеваний женской репродуктивной системы. В частности, мы исследуем влияние старения эндометриальных стромальных клеток (эСК) на функционирование эндометрия – ткани, выстилающей внутреннюю полость матки и контактирующей с эмбрионом в ходе имплантации. Результаты наших недавних фундаментальных работ демонстрируют негативное влияние стареющих эСК как на прегравидарную подготовку ткани эндометрия к последующей имплантации, так и непосредственно на сам процесс имплантации (https://doi.org/10.1093/humrep/deac112; https://doi.org/10.1093/molehr/gaac039). Кроме того, мы показали, что использование сеноморфных соединений, уменьшающих выраженность фенотипа старения, способно частично восстанавливать нарушенные свойства эндометрия. Более эффективной альтернативой сеноморфным подходам являются сенолитические подходы, позволяющие направленно убивать стареющие клетки. К сожалению, при тестировании наиболее распространённых соединений с сенолитической активностью, нам не удалось обнаружить сенолитика, эффективного в отношении сенесцентных эСК (doi: 10.1007/s00018-021-03980-x; doi: 10.3390/ijms232214251). Одновременно с этим, открытым оставался вопрос о критериях назначения сенотерапии конкретным пациентам с нарушениями имплантации. Поиск ответов на эти вопросы и лег в основу двух ключевых задач настоящего проекта. Первая задача направлена на разработку нового подхода для поиска сенолитиков, который позволит идентифицировать высокоспецифичные и эффективные сенолитики в отношении стареющих эСК. Вторая задача предполагает создание клинического показателя, который будет отражать целесообразность назначения сенолитиков конкретному пациенту с эндометриальной патологией для восстановления рецептивности ткани. В первый год реализации проекта было инициировано выполнение обеих задач. Гипотеза, лежащая в основе разрабатываемого нами подхода для поиска сенолитиков, заключается в предположении о том, что сенесцентные клетки характеризуются дисбалансом в работе гомеостатических систем. В этом случае воздействие, дополнительно нарушающее работу систем поддержания гомеостаза, может оказаться критичным для сенесцентных клеток, но будет скомпенсировано контрольными. Используя биоинформатический анализ данных РНК-секвенирования образцов контрольных и стареющих эСК, с одной стороны, и классические in vitro эксперименты, с другой, нам действительно удалось выявить значительные нарушения в работе ключевых систем поддержания гомеостаза в сенесцентных эСК. А именно, мы продемонстрировали, что старение эСК сопровождается деполяризацией плазматической мембраны, снижением внутриклеточного рН, падением мембранного потенциала митохондрий и блокированием аутофагии. На основании этих данных далее мы протестировали ряд соединений для направленного воздействия на эти показатели: оуабаин (вызывающий деполяризацию плазматической мембраны клеток), амилорид (способствующий закислению цитозоля), валиномицин (приводящий к падению мембранного потенциала митохондрий), NH4Cl (блокирующий аутофагию) и нигирицин (комплексно воздействующий на все параметры). Оказалось, что воздействия на отдельные указанные параметры стареющих эСК при помощи оуабаина, амидлорида, валиномицина и NH4Cl не приводят к индукции сенолизиса. Однако, комплексное воздействие на несколько систем поддержания гомеостаза при помощи нигирицина в широком диапазоне концентраций приводит к значительно более выраженной гибели стареющих эСК по сравнению с контрольными клетками, однозначно демонстрируя его сенолитическую активность в отношении стареющих эСК. Таким образом, нам удалось разработать новый подход для поиска соединений с сенолитической активностью и использовать его для идентификации нового сенолитика нигирицина, эффективного в отношении стареющих эСК. Целью задачи 2 является разработка клинического показателя для назначения сенолитиков для коррекции рецептивности ткани в случаях ее нарушения. Фундаментальную основу такого клинического показателя составит оценка экспрессии набора генов, позволяющих однозначно и надежно идентифицировать стареющие эСК в образцах биопсии эндометрия. При решении этой задачи важно учитывать несколько моментов: (1) биопсия ткани, помимо интересующих нас стромальных клеток, содержит множество других клеточных типов; (2) на сегодняшний день нет универсального набора генов, однозначно маркирующего стареющие клетки в тканях и, тем более, в эндометрии; (3) конкретные генные паттерны, характеризующие состояние старения, могут в значительной степени зависеть от типа клеток и ткани. Таким образом, наша задача заключалась не в создании универсального набора генов, который бы характеризовал стареющие клетки, а в разработке универсального подхода для поиска сенесцентных клеток в различных тканях, который бы позволял получать высокоспецифичные генные характеристики для стареющих клеток конкретного типа. На начальных этапах разработки алгоритма мы «искали» сенесцентные клетки в данных секвенирования единичных клеток для трех мышиных моделей повреждения тканей, в которых ранее было экспериментально установлено появление сенесцентных клеток. Для каждой отдельной модели повреждения мы выделяли сабсет данных, характеризующий экспрессию генов в стромальных клетках, и анализировали внутреннюю структуру таких данных в виде графа. Такой подход позволил выявить отдельные внутренние генные модули/сигнатуры, специфичные для стромальных клеток каждой исследуемой модели. Среди обнаруженных генных модулей при помощи заданных критериев, которые включали (1) положительную корреляцию с универсальной сигнатурой старения SenMayo; (2) выраженное увеличение экспрессии данного генного модуля при повреждении ткани; (3) специфичность его экспрессии для стромальных клеток; (4) функциональную характеристику генов модуля по процессам, типичным для клеточного старения (ремоделирование ткани, аттракция лейкоцитов, негативная регуляция клеточного цикла), нам удалось идентифицировать внутреннюю сигнатуру клеточного старения для каждой из протестированных моделей повреждения. Таким образом, был разработан новый подход для идентификации клеточного старения в тканях на уровне единичных клеток. Далее, используя доступные данные секвенирования единичных клеток образцов тканей здоровых и фибротических легких человека, мы продемонстрировали применимость разработанного подхода для идентификации сенесцентных клеток в образцах человеческих тканей. Наконец, мы использовали разработанный подход для поиска стареющих эСК в эндометрии человека. Применение нашего алгоритма позволило выявить внутренние сигнатуры клеточного старения, специфичные для эСК в каждой из фаз менструального цикла. При пересечении списков генов этих внутренних сигнатур мы сформировали уникальный набор из 70 генов, позволяющий идентифицировать стареющие эСК в ткани эндометрия вне зависимости от фазы менструального цикла. Более того, нам удалось выявить существенное обогащение фракции стромальных клеток образцов тонкого эндометрия по внутренней сигнатуре клеточного старения, что наглядно продемонстрировало применимость разработанного нами уникального набора генов для идентификации стареющих клеток при патологиях эндометрия и свидетельствовало в пользу целесообразности сенолитического подхода для коррекции его рецептивности. Таким образом, все задачи, запланированные на первый год реализации проекта, были успешно выполнены.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Ранее мы установили, что старение эндометриальных стромальных клеток (эСК) нарушает децидуальную трансформацию эндометрия и негативно влияет на процесс имплантации эмбриона. Современным подходом для устранения негативного влияния стареющих клеток на функционирование органов и тканей является использование сенолитиков. Сенолитики представляют собой соединения самой различной природы, которые позволяют направлено удалять стареющие клетки. К сожалению, при тестировании наиболее распространённых соединений с сенолитической активностью, нам не удалось обнаружить сенолитика, эффективного в отношении стареющих эСК (doi: 10.1007/s00018-021-03980-x; doi: 10.3390/ijms232214251). В связи с этим, одна из задач настоящего проекта предполагала разработку нового подхода для поиска сенолитиков, который позволил бы идентифицировать высокоспецифичные и эффективные сенолитики для стареющих эСК. Суть разрабатываемого подхода заключалась в комплексном воздействии на несколько ключевых систем, обеспечивающих поддержание гомеостаза и жизнеспособности стареющих эСК. В первый год работы по проекту, используя данный подход, нам удалось идентифицировать новое соединение, обладающее выраженной сенолитической активностью в отношении стареющих эСК – нигирицин. Второй год работы в рамках этой задачи заключался в детальном изучении молекулярных механизмов, обуславливающих сенолитическое действие нигирицина. Нигирицин является мобильным ионофором, который обеспечивает электронейтральный обмен ионов K+ на ионы H+ по градиенту концентрации, что приводит к оттоку K+ из клетки ввиду его более высокого внутриклеточного содержания. Постановка серий экспериментов по модуляции уровня K+ выявила, что сенолитический эффект нигирицина обусловлен более низким уровнем внутриклеточного K+ в стареющих эСК по сравнению с контрольными клетками, что приводит к более быстрому оттоку этих ионов из клеток. Известно, что отток K+ может запускать особый тип клеточной гибели – пироптоз. И, действительно, анализ содержания IL-1β в культуральной среде, результаты двойного окрашивания на Annexin V/DAPI и ингибирования активности каспазы-1 свидетельствовали в пользу запуска пироптотической гибели при действии нигирицина. Более того, анализ данных РНК-секвенирования выявил повышенную экспрессию генов, входящих в онтологический модуль “Response to lipopolysaccharide” в стареющих эСК, что может свидетельствовать о предрасположенности стареющих эСК к пироптозу. Таким образом, нам удалось установить, что на молекулярном уровне специфичность и эффективность нигирицина в отношении стареющих эСК обусловлена более низким содержанием внутриклеточного K+ и повышенной экспрессией ряда генов, участвующих в реализации пироптоза, по сравнению с контрольными клетками. Важной характеристикой любого сенолитика является его универсальность, то есть способность оказывать сенолитическое действие вне зависимости от индуктора клеточного старения и конкретного клеточного типа. Использование ряда моделей, включая доксорубицин-индуцированное старение мезенхимных стволовых клеток из пульпы зуба, Н2О2-индуцированное старение мезенхимных стволовых клеток Вартонова студня, этопозид-индуцированное старение эпителиальных клеток карциномы легких A549, репликативное старение эСК, однозначно свидетельствовало о широком спектре сенолитического действия нигирицина. Наконец, еще одним существенны фактором, обуславливающим возможность применения того или иного сенолитика в клинике, является разработка безопасного и эффективного протокола для его использования. Нам удалось разработать схему пульсовой обработки клеток нигирицином, которая приводила к эффективной элиминации стареющих эСК и практически не влияла на свойства контрольных клеток. Суммируя все результаты, полученные в рамках первой задачи, мы обнаружили новый сенолитик широкого спектра действия – нигирицин, установили молекулярные основы селективности его действия и разработали подход для эффективной элиминации стареющих эСК. Другими словами, мы «имеем в руках» лекарство, теперь необходимо определиться с критериями его назначения. Глобальной целью второй задачи проекта являлась разработка клинического показателя для последующего назначения сенолитиков для коррекции рецептивности ткани в случаях ее нарушения. Фундаментальную основу такого клинического показателя составила оценка экспрессии набора генов, позволяющих однозначно и надежно идентифицировать стареющие эСК в образцах биопсии эндометрия. В ходе реализации задач первого года нам удалось разработать оригинальный подход для идентификации клеточного старения в тканях на уровне единичных клеток. Применив разработанный подход для анализа доступных данных секвенирования единичных клеток образцов эндометрия, полученных из всех фаз менструального цикла, мы получили набор из 70 генов, позволяющий идентифицировать стареющие эСК вне зависимости от фазы цикла. Последующий анализ обогащения по такому набору генов выявил волновое развитие сенесцентной реакции в стромальных клетках в ткани эндометрия. Наконец, мы продемонстрировали возможность использования разработанного нами списка генов для поиска стареющих клеток в тонком эндометрии, являющимся риск-фактором для неудач имплантации. По результатам проведенного анализа мы обнаружили более выраженную сенесценцию в образцах от доноров с тонким эндометрием. Второй год работы по этой задаче был направлен на оценку возможности использования сета генов, маркирующего стареющие эСК, при анализе транскриптомных данных патологий эндометрия, непосредственно связанных с нарушениями имплантации. В этом контексте мы сфокусировались на исследовании многократных неудач имплантации, которые определяются как три последовательные неудачи имплантации при переносе эмбрионов хорошего качества. Принципиальным отличием данных, имеющихся в открытом доступе, для многократных неудач имплантации от таковых для тонкого эндометрия является момент забора биоматериала. В случае тонкого эндометрия забор проводился в пролиферативной фазе, тогда как для многократных неудач имплантации образцы выделяли из средне-секреторной фазы в период предполагаемого «окна имплантации». Это принципиально важно для адекватной интерпретации получаемых в ходе анализа результатов. Учитывая динамическую природу эндометрия и биологические основы децидуализации, аномальное присутствие стареющих эСК в пролиферативной фазе должно приводить к нарушению полноценной децидуальной трансфорамации стромы, то есть к менее выраженному образованию субпопуляций стареющих и зрелых децидуальных клеток (обе субпопуляции появляются в норме и необходимы для успешной имплантации). Соответственно, на имеющихся транскриптомных данных для многократных неудач имплантации мы ожидали получить снижение выраженности экспрессии набора генов, маркирующих стареющие эСК, что являлось бы свидетельством присутствия большего количества стареющих эСК в пролиферативной фазе и служило бы обоснованием для назначения сенолитиков. Наряду с анализом обогащения по списку генов, маркирующих стареющие эСК, мы оценивали выраженность экспрессии набора генов, характеризующего зрелые децидуальные клетки. Как и ожидалось, во всех проанализированных датасетах выраженность генных сигнатур, маркирующих стареющие и зрелые децидуальные клетки, была снижена в случае патологии по сравнению с образцами от здоровых фертильных доноров. Наконец, в рамках финальной задачи проекта мы разработали клинический показатель для диагностики нарушений рецептивности эндометрия, позволяющий выявлять необходимость назначения сенолитиков. Данный показатель основывается на оценке экспрессии 24 генов (8 маркируют стареющие эСК, 8 – зрелые децидуальные клетки, 8 являются референсными). Алгоритм для диагностики рецептивного статуса эндометрия у пациентов предполагает забор биопсии эндометрия в средне-секреторной фазе в период «окна имплантации» в цикле, предшествующем циклу подсадки эмбриона, оценку экспрессии 24 репрезентативных генов в полученном материале методом ПЦР и расчет интегрального показателя «IF risk score» на основании показателей обогащения по сигнатурам стареющих и зрелых децидуальных клеток. Интеграция результатов такого анализа для конкретного пациента с имеющимся референсным набором позволит прогнозировать исход имплантации и определить необходимость дополнительной корректирующей терапии, в частности сенотерапии в пролиферативной фазе для конкретного пациента.