КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-74-10031

НазваниеНовые аспекты функционирования универсальных регуляторных белков семейства 14-3-3

РуководительСлучанко Николай Николаевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2024 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (41).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словабелки 14-3-3, структура белка, белок-белковые взаимодействия, фосфорилирование, конформационные изменения, пептиды, мотивы узнавания, молекулярные интерфейсы, шапероно-подобная активность, агрегация, антиагрегационная активность

Код ГРНТИ34.15.17


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Исследования белков 14-3-3 значимы и актуальны, поскольку они являются мощными регуляторами важных процессов в живой клетке за счет взаимодействия с сотнями фосфорилированных белков-партнеров. Комплексы 14-3-3 рассматриваются как перспективная мишень для разработки лекарств, что требует исследования механизмов их образования и структуры. На стадии Проекта 2019 были получены данные мирового уровня (7 статей в журналах Q1 и 9 структур, депонированных в PDB) о механизмах взаимодействия и структуре комплексов белков 14-3-3 cо стероидогенным регуляторным белком STARD1, проапоптотическим белком BAD, а также компонентами вирусов – онкобелком E6 вируса папилломы человека и нуклеокапсидным белком (N) SARS-CoV-2. Проведенная работа выявила новые интересные направления исследования или принципиальные вопросы, которые будут решены в рамках продления Проекта 2019. При исследовании взаимодействия 14-3-3 с SARS-CoV-2 N была показана важная роль фосфорилирования Ser197 в узнавании белками 14-3-3. Однако природный «испанский вариант» SARS2 N с мутацией S197L также был способен взаимодействовать с 14-3-3 при фосфорилировании, что указывало на наличие других 14-3-3-связывающих фосфосайтов. Наиболее интересен участок Thr205, который есть в составе MERS N, но отсутствует у SARS1 N. Для исследования его роли будет получен вариант белка с заменой 205TAG для сайт-направленного включения фосфосерина (pSer) или его негидролизуемого аналога (nhpSer) и изучения его роли в образовании комплекса с 14-3-3. Будет проведено сравнение 197TAG и 205TAG вариантов полноразмерного N, и получена модель структуры комплекса 14-3-3/N в растворе на основе SAXS данных. Интересным белком-партнером 14-3-3 является белок нуклеофосмин (NPM1) человека, который регулирует амплификацию центриолей, структуру ядрышка и в случае мутаций приводит к онкогенезу, однако механизм взаимодействия 14-3-3 и NPM1 белков не изучен. NPM1 является пентамером и содержит множество участков фосфорилирования, некоторые из которых находятся в N-концевом домене олигомеризации и напоминают 14-3-3-связывающие последовательности в других белках. Мы исследуем фосфорилирование NPM1 человека, установим ключевые фосфорилируемые участки и получим варианты с заменами этих участков на TAG с целью сайт-направленного включения nhpSer. Будет исследовано влияние точечного фосфорилирования на олигомерное состояние NPM1 и его взаимодействие с 14-3-3. Будут созданы химеры 14-3-3 с фосфопептидами NPM1 и ацетилхолинового рецептора альфа-7 и получены их первые кристаллические структуры, характеризующие ключевые интерфейсы. В отличие от фрагментов NPM1 и a7, во многих белках-партнерах 14-3-3 имеются соседние фосфорилируемые остатки, что сильно затрудняет исследование их роли. Таким примером служит пептид проапоптотического белка BAD, который может быть фосфорилирован по соседним участкам, каждый из которых образует комплекс с 14-3-3 (Ser74 и Ser75). Для подобных случаев мы предполагаем использовать кодонную супрессию и сайт-специфическое введение nhpSer (остаток фосфонометилаланина, РМА). Мы применим такую химеру для получения первой структуры комплекса 14-3-3 с РМА-пептидом. Для исследования взаимодействий 14-3-3 с пептидами мы разработаем новую систему получения рекомбинантных пептидов, основанную на сочетании подходов, отработанных и использованных нами по-отдельности на этапе Проекта 2019. Мы рассчитываем, что по применимости такая система не будет уступать более дорогому получению синтетических фосфопептидов. Таким образом, все новые задачи тесно связаны с предыдущими, выполнявшимися в проекте, что свидетельствует о научном единстве Проекта 2022 с Проектом 2019 и его логичном продолжении. В результате будут получены новые представления о роли фосфорилирования конкретных участков в целом ряде белков человека и белковых компонентов вирусов в узнавании их белками-регуляторами семейства 14-3-3 человека. Ожидаются результаты мирового значения, которые будут опубликованы в престижных международных журналах.

Ожидаемые результаты
В результате проекта будут получены новые представления о роли фосфорилирования конкретных участков в целом ряде белков человека и белковых компонентов вирусов в узнавании их белками-регуляторами семейства 14-3-3 человека. Планируется получить новую информацию о роли фосфорилирования участков, находящихся в зоне межсубъединичных интерфейсов олигомерных белков (14-3-3 дзета, NPM1), в том числе в составе белков, подверженных многоточечному фосфорилированию (NPM1 и SARS-CoV-2 N). Исследование таких белков, через которых белки 14-3-3 координируют те или иные физиологические процессы, как правило затруднено из-за сложностей получения их определенным образом фосфорилированных форм (неполное фосфорилирование целевых участков и фосфорилирование побочных участков). На этапе продления проекта РНФ планируется решить целый ряд новых задач, связанных с сайт-специфическим фосфорилированием, за счет использования новой системы амбер-кодонной супрессии (в сотрудничестве с Prof Richard Cooley). Будет получен ряд мутантных форм белков NPM1, 14-3-3 дзета, SARS-CoV-2 N, а также рекомбинантных фьюжн-конструкций, содержащих функциональные пептиды, в которых на месте фосфорилируемых остатков будут ко-трансляционно включены остаток фосфосерина (pSer) или его негидролизуемого аналога (nhpSer). Это позволит сфокусироваться на роли именно этих остатков и позволит лучше понять те аспекты функционирования белков 14-3-3, которые были исследованы на этапе основной части Проекта 2019. Будет расшифрована роль фосфорилирования в регуляции олигомерного состояния 14-3-3 дзета и NPM1, а также в регуляции взаимодействия NPM1 и SARS-CoV-2 N с белками 14-3-3, взаимодействия NPM1 с SARS-CoV-2 N. Будет получена информация о структуре некоторых комплексов 14-3-3 с фосфорилированными фрагментами белков, имеющих важное физиологическое значение (NPM1, BAD, a7 AcChR). Будет построена первая модель пространственной структуры комплекса белка 14-3-3 с полноразмерным нуклеокапсидным белком коронавируса. Эти результаты представляют фундаментальный интерес с точки зрения понимания взаимодействия компонентов клетки хозяина и вирусных белков при развитии инфекции и смогут помочь в создании новых подходов к антивирусной терапии в будущем. В результате выполнения проекта будет разработан удобный способ получения рекомбинантных фосфопептидов, в том числе несущих на месте фосфорилируемого остатка nhpSer, будет показана эквивалентность использования такого способа использованию синтетических фосфопептидов. Ожидаются результаты мирового значения, которые будут опубликованы в престижных международных журналах.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Результаты, полученные на первом этапе работы, были представлены на молодежных школах-конференциях в виде постерного и устного докладов, вошли в магистерскую диссертационную работу участницы проекта Капитоновой А.А. и были опубликованы в виде 4 статей в журналах Q1 (2 - Protein Science, 1 - BBRC и 1 - J Mol Biol). Эти результаты соответствуют следующим направлениям исследований: 1. Первое направление посвящено исследованию взаимодействия 14-3-3 с нуклеокапсидным белком коронавируса SARS-CoV-2. Нуклеокапсидный белок (нуклеопротеин, или N-белок) является общим для одноцепочечных РНК-вирусов, включая коронавирусы, и отвечает за синтез, упаковку и хранение вирусного наследственного материала. В его структуре есть центральный регуляторный SR-богатый регион, коротый подвергается множественному фосфорилированию под действием протеинкиназ клетки-хозяина и часто мутирует у коронавируса. Мы показали, что фосфорилирование SARS-CoV-2 N либо по остатку Ser197, либо по остатку Thr205 необходимо и достаточно для образования прочного комплекса с белками 14-3-3, при этом во всех случаях фосфо-Thr205 приводит к более аффинному связыванию. Такой вывод был сделан при исследовании фосфопептидов N белка и был прямо подтвержден при исследовании полноразмерного N (419 остатков), содержащего фосфосерин в единственном положении (либо 197, либо 205). Такой результат мы смогли получить только с использованием системы расширения генетического кода, при трансляционном включении фосфосерина (или его негидролизуемого аналога) вместо ТАГ кодона. Было показано, что включение фосфосерина приводит к получению частично дефосфорилированных препаратов (из-за спонтанного гидролиза), в то время как включение nhpSer позволяет избежать этой проблемы. Несмотря на то, что основной участок связывания 14-3-3 лежит в SR-богатой области N белка, нам удалось также выявить новый потенциальный участок связывания 14-3-3, расположенный в N конце N белка (остаток Thr16). Взаимодействие 14-3-3 и N-белка приводит к тому, что регуляторный SR-регион оказывается защищенным от действия фосфатаз клетки, которые не могут удалить фосфатные группы с регуляторной области, что влияет на жизненный цикл вируса. По материалам этого направления нами опубликованы статьи в журналах J Mol Biol и Protein Science, вышедшие в 2023 году. Эти успехи широко освещены в СМИ (например, https://inscience.news/ru/article/russian-science/12010 и https://microbius.ru/news/rol-mutatsii-v-nukleoproteine-sars-cov-2 и https://colab.ws/news/567 и https://www.fbras.ru/rol-mutatsii-v-nukleoproteine-sars-cov-2.html ). 2. Второе направление было посвящено разработке метода получения рекомбинантных фосфорилированных олигопептидов. Получение индивидуальных олигопептидов в бактериальной системе, которая широко используется для экспрессии белков, затруднено ввиду их нестабильности, деградации и сложности очистки (малый размер). В своей работе мы предположили, что пептиды можно получать в составе сложных химерных конструкций, в которых последовательность пептида фланкирована отщепляемыми фьюжн-партнерами. Для получения рекомбинантных фосфопептидов был создан прототип химеры, несущий на N-конце гис-SUMO-таг, который можно отщеплять от пептида с помощью специфичной SUMO-гидролазы, а на С-конце – желтый флуоресцентный белок YFP, который отделен от последовательности пептида сайтом расщепления тромбина LVPR/GS. Наличие YFP на самом конце конструкции позволяет по флуоресценции следить за полным прочтением всей химерной конструкции. Дизайн конструкции подразумевает наличие остатка триптофана на С конце пептида для удобства и точности определения концентрации пептида после откусывания фьюжн-партнеров. Наличие фосфорилируемых остатков серина/треонина в центре последовательности пептида подтверждено с помощью LC-MS. Ввиду наличия побочного фосфорилирования в составе конструкции при ко-экспрессии с протеинкиназой, предусмотрено использование системы расширения генетического кода и направленного включения фосфосерина в центральное положение целевого пептида. В дальнейшем такой подход будет применяться в рамках настоящего проекта и за его пределами. 3. Третье направление было посвящено исследованию взаимодействия белков 14-3-3 с белком нуклеофосмином человека. Нуклеофосмин (NPM1) – многофункциональный белок, необходимый для биогенеза рибосом, нормальной пролиферации и дифференцировки клеток. В клетке NPM1 чаще всего находится в ядрышке в виде гомопентамера, образованного с помощью консервативного N-концевого олигомеризационного домена. Перемещения NPM1 между ядром и цитоплазмой контролируются посредством изменения олигомерного состояния и взаимодействия с другими клеточными факторами, тогда как равновесие пентамер-мономер регулируется при помощи фосфорилирования и взаимодействия с белками-партнёрами. Одним из предполагаемых белков-партнеров является белок 14-3-3, однако, как фосфорилирование NPM1 влияет на его олигомерное состояние и связывание с 14-3-3, пока не понятно. Мы получили рекомбинантный белок NPM1 в нефосфорилированной и фосфорилированной форме, исследовали паттерн фосфорилирования NPM1 при его ко-экспрессии с ПКА. Показано, что ПКА фосфорилирует многие участки в NPM1, которые обнаружены в фосфорилированном состоянии in vitro. Показано, что множественное фосфорилирование дестабилизирует олигомеры NPM1, но недостаточно для экспонирования и фосфорилирования ключевого остатка Ser48, который, предположительно, играет роль основного участка связывания белков 14-3-3. Для проверки этого предположения был получен ряд мутантных форм полноразмерного белка NPM1, а также химерная конструкция, состоящая из 14-3-3 и фрагмента NPM1 в области Ser48. Такая химера получена в нефосфорилированном и фосфорилированном виде и статус фосфорилирования Ser48 подтвержден методами SEC-MALS и Thermofluor. Мутантные варианты NPM1 будут исследованы на следующем этапе проекта, химера 14-3-3-NPM1(48) будет закристаллизована и использована для расшифровки пространственной структуры. Результаты по этому направлению вошли в состав статьи, опубликованной в 2022 году в BBRC, а также были освещены в СМИ https://rscf.ru/news/presidential-program/fosfatnaya-metka-okazalas-vazhnoy-dlya-regulyatsii-belka-mutatsiya-kotorogo-vyzyvaet-leykoz/ и https://scientificrussia.ru/articles/fosfatnaa-metka-okazalas-vaznoj-dla-regulacii-belka-mutacia-kotorogo-vyzyvaet-lejkoz 4. Четвертое направление посвящено исследованию основы регуляции ацетилхолиновых нейрорецепторов под действием белков 14-3-3. В рамках направления была клонирована новая химера 14-3-3дзета, несущая пептидный фрагмент регуляторной цитоплазматической петли никотинового альфа7 AChR – QRRCS(365)LASMEVS – для которого было показано фосфорилирование in vitro и in vivo под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы. В составе химеры предусмотрен линкер GGGG для облегчения связывания фосфопептида AChR в амфипатической бороздке 14-3-3. Нефосфорилированная и фосфорилированная формы химеры были очищены и исследованы с помощью методов SEC-MALS и Thermofluor для анализа олигомерного состояния (размера) и термостабильности. Проведенное сравнение позволило однозначно показать, что в результате коэкспрессии получается фосфорилированная форма химеры 14-3-3-а7, которая далее будет использована в кристаллизационном скрининге и структурных исследованиях. 5. Получены новые результаты по направлению исследования взаимодействия 14-3-3 с проапоптотическим белком BAD. Для того чтобы получить структуры 14-3-3 с каноническими пептидами BAD, фосфорилированными по серину-75 и серину-99 мы создали химеру 14-3-3-BAD, в которой вместо фосфорилируемых остатков были оставлены ТАГ кодоны, для направленного включения остатков фосфосерина (или его негидролизуемого аналога). Было показано, что такой вариант химеры экспрессируется и является фосфорилированным по данным Phos-tag гелей, что делает возможным его дальнейшую кристаллизацию и структурное исследование на предстоящем этапе проекта.

 

Публикации

1. Жу П.Л., Нгуен К.Т., Эстель А.Б., Случанко Н.Н., Мель Р.А., Кули Р.Б. Genetic encoding of 3-nitro-tyrosine reveals the impacts of 14-3-3 nitration on client binding and dephosphorylation Protein Science, том 32, выпуск 3, e4574 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1002/pro.4574

2. Капитонова А.А., Тугаева К.В., Варфоломеева Л.А., Бойко К.М., Кулей Р.Б., Случанко Н.Н. Structural basis for the recognition by 14-3-3 proteins of a conditional binding site within the oligomerization domain of human nucleophosmin Biochemical and biophysical research communications, 627, 176-183 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2022.08.047

3. Ли Ю., Редзич Ж.С., Савиола Э.Дж., Ли С., Эбмайер К.С., Кутателадзе Т., Хансен К.Ч., Чжао Р., Ан Н., Случанко Н.Н., Эйзенмессер Э. Molecular insight into the specific interactions of the SARS-Coronavirus-2 nucleocapsid with RNA and host protein Protein Science, т. 32, выпуск 4, e4603 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1002/pro.4603

4. Тугаева К.В., Сысоев А.А., Капитонова А.А., Смит Дж.Л.Р., Жу Ф., Кулей Р.Б., Антсон А.А., Случанко Н.Н. Human 14-3-3 Proteins Site-selectively Bind the Mutational Hotspot Region of SARS-CoV-2 Nucleoprotein Modulating its Phosphoregulation Journal of Molecular Biology, том 435, выпуск 2, 167891 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.jmb.2022.167891

5. Капитонова А.А., Тугаева К.В., Варфоломеева Л.А., Бойко К.М., Кули Р.Б., Случанко Н.Н. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ СВОЙСТВ БЕЛКА НУКЛЕОФОСМИНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, 2023 г, том 1, выпуск 1, стр. 16 (год публикации - 2023)

6. - «Фосфатная метка» оказалась важной для регуляции белка, мутация которого вызывает лейкоз сайт РНФ, - (год публикации - )

7. - «Фосфатная метка» оказалась важной для регуляции белка, мутация которого вызывает лейкоз Seldon.news, - (год публикации - )

8. - «ФОСФАТНАЯ МЕТКА» ОКАЗАЛАСЬ ВАЖНОЙ ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ БЕЛКА, МУТАЦИЯ КОТОРОГО ВЫЗЫВАЕТ ЛЕЙКОЗ Информация взята с портала «Научная Россия» (https://scientificrussia.ru/) Научная Россия, - (год публикации - )

9. - «Фосфатная метка» оказалась важной для регуляции белка, мутация которого вызывает лейкоз ПОИСК, - (год публикации - )