Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Результаты, полученные на первом этапе работы, были представлены на молодежных школах-конференциях в виде постерного и устного докладов, вошли в магистерскую диссертационную работу участницы проекта Капитоновой А.А. и были опубликованы в виде 4 статей в журналах Q1 (2 - Protein Science, 1 - BBRC и 1 - J Mol Biol). Эти результаты соответствуют следующим направлениям исследований: 1. Первое направление посвящено исследованию взаимодействия 14-3-3 с нуклеокапсидным белком коронавируса SARS-CoV-2. Нуклеокапсидный белок (нуклеопротеин, или N-белок) является общим для одноцепочечных РНК-вирусов, включая коронавирусы, и отвечает за синтез, упаковку и хранение вирусного наследственного материала. В его структуре есть центральный регуляторный SR-богатый регион, коротый подвергается множественному фосфорилированию под действием протеинкиназ клетки-хозяина и часто мутирует у коронавируса. Мы показали, что фосфорилирование SARS-CoV-2 N либо по остатку Ser197, либо по остатку Thr205 необходимо и достаточно для образования прочного комплекса с белками 14-3-3, при этом во всех случаях фосфо-Thr205 приводит к более аффинному связыванию. Такой вывод был сделан при исследовании фосфопептидов N белка и был прямо подтвержден при исследовании полноразмерного N (419 остатков), содержащего фосфосерин в единственном положении (либо 197, либо 205). Такой результат мы смогли получить только с использованием системы расширения генетического кода, при трансляционном включении фосфосерина (или его негидролизуемого аналога) вместо ТАГ кодона. Было показано, что включение фосфосерина приводит к получению частично дефосфорилированных препаратов (из-за спонтанного гидролиза), в то время как включение nhpSer позволяет избежать этой проблемы. Несмотря на то, что основной участок связывания 14-3-3 лежит в SR-богатой области N белка, нам удалось также выявить новый потенциальный участок связывания 14-3-3, расположенный в N конце N белка (остаток Thr16). Взаимодействие 14-3-3 и N-белка приводит к тому, что регуляторный SR-регион оказывается защищенным от действия фосфатаз клетки, которые не могут удалить фосфатные группы с регуляторной области, что влияет на жизненный цикл вируса. По материалам этого направления нами опубликованы статьи в журналах J Mol Biol и Protein Science, вышедшие в 2023 году. Эти успехи широко освещены в СМИ (например, https://inscience.news/ru/article/russian-science/12010 и https://microbius.ru/news/rol-mutatsii-v-nukleoproteine-sars-cov-2 и https://colab.ws/news/567 и https://www.fbras.ru/rol-mutatsii-v-nukleoproteine-sars-cov-2.html ). 2. Второе направление было посвящено разработке метода получения рекомбинантных фосфорилированных олигопептидов. Получение индивидуальных олигопептидов в бактериальной системе, которая широко используется для экспрессии белков, затруднено ввиду их нестабильности, деградации и сложности очистки (малый размер). В своей работе мы предположили, что пептиды можно получать в составе сложных химерных конструкций, в которых последовательность пептида фланкирована отщепляемыми фьюжн-партнерами. Для получения рекомбинантных фосфопептидов был создан прототип химеры, несущий на N-конце гис-SUMO-таг, который можно отщеплять от пептида с помощью специфичной SUMO-гидролазы, а на С-конце – желтый флуоресцентный белок YFP, который отделен от последовательности пептида сайтом расщепления тромбина LVPR/GS. Наличие YFP на самом конце конструкции позволяет по флуоресценции следить за полным прочтением всей химерной конструкции. Дизайн конструкции подразумевает наличие остатка триптофана на С конце пептида для удобства и точности определения концентрации пептида после откусывания фьюжн-партнеров. Наличие фосфорилируемых остатков серина/треонина в центре последовательности пептида подтверждено с помощью LC-MS. Ввиду наличия побочного фосфорилирования в составе конструкции при ко-экспрессии с протеинкиназой, предусмотрено использование системы расширения генетического кода и направленного включения фосфосерина в центральное положение целевого пептида. В дальнейшем такой подход будет применяться в рамках настоящего проекта и за его пределами. 3. Третье направление было посвящено исследованию взаимодействия белков 14-3-3 с белком нуклеофосмином человека. Нуклеофосмин (NPM1) – многофункциональный белок, необходимый для биогенеза рибосом, нормальной пролиферации и дифференцировки клеток. В клетке NPM1 чаще всего находится в ядрышке в виде гомопентамера, образованного с помощью консервативного N-концевого олигомеризационного домена. Перемещения NPM1 между ядром и цитоплазмой контролируются посредством изменения олигомерного состояния и взаимодействия с другими клеточными факторами, тогда как равновесие пентамер-мономер регулируется при помощи фосфорилирования и взаимодействия с белками-партнёрами. Одним из предполагаемых белков-партнеров является белок 14-3-3, однако, как фосфорилирование NPM1 влияет на его олигомерное состояние и связывание с 14-3-3, пока не понятно. Мы получили рекомбинантный белок NPM1 в нефосфорилированной и фосфорилированной форме, исследовали паттерн фосфорилирования NPM1 при его ко-экспрессии с ПКА. Показано, что ПКА фосфорилирует многие участки в NPM1, которые обнаружены в фосфорилированном состоянии in vitro. Показано, что множественное фосфорилирование дестабилизирует олигомеры NPM1, но недостаточно для экспонирования и фосфорилирования ключевого остатка Ser48, который, предположительно, играет роль основного участка связывания белков 14-3-3. Для проверки этого предположения был получен ряд мутантных форм полноразмерного белка NPM1, а также химерная конструкция, состоящая из 14-3-3 и фрагмента NPM1 в области Ser48. Такая химера получена в нефосфорилированном и фосфорилированном виде и статус фосфорилирования Ser48 подтвержден методами SEC-MALS и Thermofluor. Мутантные варианты NPM1 будут исследованы на следующем этапе проекта, химера 14-3-3-NPM1(48) будет закристаллизована и использована для расшифровки пространственной структуры. Результаты по этому направлению вошли в состав статьи, опубликованной в 2022 году в BBRC, а также были освещены в СМИ https://rscf.ru/news/presidential-program/fosfatnaya-metka-okazalas-vazhnoy-dlya-regulyatsii-belka-mutatsiya-kotorogo-vyzyvaet-leykoz/ и https://scientificrussia.ru/articles/fosfatnaa-metka-okazalas-vaznoj-dla-regulacii-belka-mutacia-kotorogo-vyzyvaet-lejkoz 4. Четвертое направление посвящено исследованию основы регуляции ацетилхолиновых нейрорецепторов под действием белков 14-3-3. В рамках направления была клонирована новая химера 14-3-3дзета, несущая пептидный фрагмент регуляторной цитоплазматической петли никотинового альфа7 AChR – QRRCS(365)LASMEVS – для которого было показано фосфорилирование in vitro и in vivo под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы. В составе химеры предусмотрен линкер GGGG для облегчения связывания фосфопептида AChR в амфипатической бороздке 14-3-3. Нефосфорилированная и фосфорилированная формы химеры были очищены и исследованы с помощью методов SEC-MALS и Thermofluor для анализа олигомерного состояния (размера) и термостабильности. Проведенное сравнение позволило однозначно показать, что в результате коэкспрессии получается фосфорилированная форма химеры 14-3-3-а7, которая далее будет использована в кристаллизационном скрининге и структурных исследованиях. 5. Получены новые результаты по направлению исследования взаимодействия 14-3-3 с проапоптотическим белком BAD. Для того чтобы получить структуры 14-3-3 с каноническими пептидами BAD, фосфорилированными по серину-75 и серину-99 мы создали химеру 14-3-3-BAD, в которой вместо фосфорилируемых остатков были оставлены ТАГ кодоны, для направленного включения остатков фосфосерина (или его негидролизуемого аналога). Было показано, что такой вариант химеры экспрессируется и является фосфорилированным по данным Phos-tag гелей, что делает возможным его дальнейшую кристаллизацию и структурное исследование на предстоящем этапе проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Работа проводилась по нескольким направлениям: 1. Используя исследованное ранее взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным малым белком теплового шока человека HSPB6 в качестве модели, получен вариант белка HSPB6 с заменой фосфорилируемого остатка серина-16 на стоп-кодон ТАГ, с целью включения на месте этого кодона фосфосерина или его негидролизуемого аналога nhpS16. Полученный вариант nhpS16 HSPB6 дает сдвиг электрофоретической подвижности вверх, свидетельствующий о включении модификации (фосфонометилаланина), что было подтверждено методом масс-спектрометрии. Включение nhpS16 не влияло на димерное состояние HSPB6, но наделяло HSPB6 способностью образовывать комплексы с 14-3-3. Аналогично, нам удалось получить варианты nhpS58 и nhpS45 белка 14-3-3 дзета и показать, что они хорошо описывают поведение фосфорилированного 14-3-3. 2. Следующее направление было посвящено исследованию взаимодействия 14-3-3 с нуклеофосмином (NPM1) человека. Этот белок является мажорным компонентом ядрышка и участвует в регуляции архитектуры этого немембранного органоида, а также регулирует биогенез рибосом, ответ клетки на различные виды стресса, амплификацию центриолей и множество других процессов. Данный белок образует прочные пентамеры за счет своего N-концевого олигомеризационного домена в ядрышке, но способен выходить из ядрышка и мигрировать в цитоплазму под действием фосфорилирования. Мы обнаружили, что фосфорилирование NPM1 под действием ПКА достаточно мало эффективно, что связано, по-видимому, со стабильностью пентамерного состояния NPM1 и расположением нескольких ключевых остатков фосфорилирования в его олигомеризационном домене. По данным гель-фильтрации, такой препарат практически не был способен взаимодействовать с белками 14-3-3. Мы выбрали несколько позиций, которые расположены в олигомеризационном домене NPM1 и обнаружены в фосфорилированном состоянии in vivo, и получили варианты nhpS48 и nhpS88 с включением негидролизуемого аналога фосфосерина в эти положения. Нам удалось подтвердить экспрессию полноразмерных вариантов NPM1 с такими одиночными модификациями, а также показать, что любая из них достаточна, чтобы диссоциировать пентамер NPM1. Поскольку нам не удалось получить достаточные количества препарата, чтобы исследовать взаимодействие с белками 14-3-3 из-за крайне низкого уровня экспрессии, мы решили получить точечные мутанты с заменами остатка Thr78 или Ser112 в олигомеризационном домене NPM1 на остаток глутамата. Такие модификации должны были дестабилизировать пентамер NPM1, облегчая его фосфорилирование под действием ПКА, при этом оба остатка не способны рекрутировать 14-3-3 сами по себе. Оба белка были получены в больших количествах в гомогенном виде и были мономерами по данным SEC-MALS. В нефосфорилированном состоянии ни один из двух белков не проявил способности взаимодействовать с 14-3-3. При коэкспрессии данных белков с ПКА мы смогли получить множественно фосфорилированные формы NPM1 с фосфорилированием остатков, соответствующих in vivo сайтам фосфорилирования NPM1. Они были представлены мономерами на SEC-MALS и образовывали комплексы с 14-3-3 за счет фосфорилирования 14-3-3-связывающих мотивов в своем составе (но не за счет модификации остатков 78 и 112). Мы исследовали вторичную структуру обоих белков методом кругового дихроизма и обнаружили, что они содержат значительно больший процент разупорядоченных структурных элементов, чем исходный пентамерный NPM1. Так, мы показали, что фосфорилирование NPM1 приводит к его диссоциации из пентамера в мономер, который частично разворачивается, экспонируя новые остатки для фосфорилирования, что согласуется с данными литературы. В числе фосфорилированных остатков мы обнаружили остаток серина-48, который является основным кандидатным 14-3-3-связывающим центром в NPM1. Кристаллизация комплекса 14-3-3 с фосфорилированным фрагментом NPM1 в окрестности пептида-48 позволила подтвердить ключевую роль фосфо-группы в стабилизации комплексов с 14-3-3. Мы заметили, что степень фосфорилирования NPM1 белков T78E и S112E коррелирует с эффективностью взаимодействия с 14-3-3, однако не смогли получить стехиометрический комплекс между двумя белками вследствие неполного фосфорилирования. Поскольку мы подтвердили необходимость фосфорилирования серина-48 для рекрутирования 14-3-3 мы рассматривали варианты увеличения степени фосфорилирования NPM1 по остатку серина-48 в контексте полноразмерного белка. Для этого мы получили одиночный мутант NPM1 с заменой T46R, которая должна была выполнить сразу несколько функций. Во-первых, данная замена должна была исключить фосфорилирование остатка треонина-46, что предположительно было неблагоприятно для связывания с 14-3-3. Во-вторых, замена T46R должна была сделать окружение остатка серина-48 максимально благоприятным для его фосфорилирования под действием ПКА (RRVS). В-третьих, мы рассчитывали на то, что громоздкий остаток аргинина в положении 46, находящемся в интерфейсе субъединиц NPM1 в пентамере, приведет к дестабилизации пентамера, и тем самым далее облегчит фосфорилирование NPM1 и образование комплекса с 14-3-3. Нефосфорилированный белок T46R терял способность образовывать пентамер, однако на профиле гель-фильтрации давал два новых пика, один из которых соответствовал более диссоциированной форме, а другой соответствовал олигомеризованной форме крупнее пентамера, причем обе формы находились в равновесии друг с другом, что было подтверждено при проведении гель-фильтрации с варьированием концентрации белка в наносимом образце. Таким образом, замена T46R привела к перестройке межсубъединичных контактов. В то же время, коэкспрессия белка T46R с ПКА позволила нам получить множественно фосфорилированный препарат NPM1, который давал на гель-фильтрационном профиле единственный симметричный пик с массой, близкой к массе мономера по данным MALS. Ранний объем элюции белка указывал на то, что он является сильно развернутым, что коррелировало с данными кругового дихроизма в дальнем УФ и подтверждало идею о том, что фосфорилирование NPM1 провоцирует диссоциацию его пентамера и разворачивание мономера. Важнее всего, что мы смогли подтвердить способность такой формы NPM1 T46R к образованию стабильных комплексов с 14-3-3. Это дополнительно подтверждало роль фосфорилирования серина-48 во взаимодействии. Для того чтобы количественно охарактеризовать его, мы задались целью получить рекомбинантый пептид NPM1 соответствующий фосфорилированной форме серина-48 и содержащий негидролизуемый остаток фосфосерина-48. Такой фосфопептид был успешно получен, помечен флуоресцеином и использован для определения равновесной константы диссоциации комплексов с 14-3-3 человека на основе метода поляризации флуоресценции. Оказалось, что все семь изоформ 14-3-3 человека способны связывать фосфопептид-48, однако демонстрируют значительно отличающиеся величины Кд от 17 мкМ (гамма) до 70 мкМ (сигма). Мы обнаружили тренд изменения Кд, который четко коррелировал с общей иерархией изоформ 14-3-3 к различным фосфопептидам, который мы обнаружили ранее в ходе реализации проекта и опубликовали в Nat Commun 2021. 3. Последнее направление было посвящено анализу структур химер, состоящих из 14-3-3 и фосфорилированных фрагментов белков-партнеров – проапоптотического белка BAD и альфа7 никотинового ацетилхолинового рецептора. Нам удалось подтвердить применимость химерного подхода в получении кристаллов. Оба варианта химеры кристаллизовались, и качество дифракции позволило расшифровать пространственную структуру и выявить белок-фосфопептидные интерфейсы. Для альфа7 никотинового ацетилхолинового рецептора была получена каноническая конформация связанного фосфопептида, которая показывала участие 14-3-3 в регуляции важного класса нейрональных рецепторов. Была определена структура химеры 14-3-3 с дважды фосфорилированным фрагментом BAD, содержащим фосфосерины-75 и 99. Конформация пептида показывала, как он изгибается, обеспечивая бидентатное связывание в двух фосфопептид-связывающих центрах 14-3-3. Полученные в работе на втором этапе проекта результаты опубликованы в виде двух статей в журналах Q1. Подготовлен пресс-релиз по одной из этих работ, в результате чего она была широко освещена в СМИ (например, https://new.ras.ru/activities/news/opisana-struktura-kompleksa-reguliruyushchego-rabotu-odnogo-iz-atsetilkholinovykh-retseptorov-nervny/ и https://poisknews.ru/biotehnologii/opisana-struktura-kompleksa-reguliruyushhego-rabotu-odnogo-iz-aczetilholinovyh-reczeptorov-nervnyh-kletok/ и https://inscience.news/ru/article/russian-science/14693 ).