Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Общая схема работ в продлении проекта осталась неизменной, с включением дополнительных методов. Дополнительно собран и проанализирован материал для изучения нового патогена в структуре сезонных ОРВИ - SARS-CoV-2. Дополнительной важной составляющей проекта явилось применение метагеномного анализа респираторного корового вирома пациентов, включенных в исследование. В соответствии с планом работ в течение первого года выполнения проекта была проведена работа по организации сбора клинического материала у пациентов с респираторной симптоматикой для выявления основных респираторных вирусов человека, а также для оценки респираторного вирома. За период с октября 2022 г. по апрель 2023 г. было собрано 1074 образца клинического материала (мазки из носа и зева) от детей в возрасте от 1 месяца до 17 лет. При этом 612/1074 (57%) образцов было получено от мальчиков и 462/1074 (43%) образца получено от девочек. 59,3% (637/1074) образцов приходилось на возраст 0 – 2 лет, 25,6% (275/1074) – 3-6 лет, 15,1% (162/1074) – 7-17 лет. В собранном клиническом материале выявляли генетический материал респираторных вирусов, включая орто- (hRsv) и метапневмовирусы (hMpv) человека, а также вирусы гриппа (hIfv) А и В, риновирус (hRv), вирусы парагриппа (hPiv), коронавирусы человека (hCov) – OC43, 229E, NL63, HKU1, аденовирус (hAdv) и бокавирус (hBov), а также новый коронавирус SARS-CoV2. В структуре ОРВИ у детей в 2022 – 2023 гг. преобладали респираторно-синцитиальный вирус и вирус гриппа, которые были выявлены в 17,5% и 15,4% образцов, соответственно. Риновирус был выявлен у 10,6% детей. Остальные респираторные вирусы выявлялись менее чем в 10% случаев. Вирус SARS-CoV-2 был выявлен у 2,8% пациентов. Этиологическая структура ОРВИ у детей г. Новосибирска в 2022 – 2023 гг. представлена на рисунке 4. Был проведен сравнительный статистический анализ частоты моно- и коинфекций у различных вирусов.0,003), hPiv (AR = 1,95, p = 0,051) над моноинфекциями соответствующих вирусов. По итогам анализа этиологической структуры респираторных вирусных инфекций у детей в течение трех эпидемических сезонов и влияния пандемии нового коронавируса на распространение респираторных вирусов опубликована статья в «Viruses». В течение сезона 2022 – 2023 гг. было выявлено 188 образцов клинического материала, положительных на респираторно-синцитиальный вирус человека. Создана коллекция штаммов респираторно-синцитиального вируса человека. В Государственную коллекцию вирусов гриппа и ОРЗ, ФГБНУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева" Минздрава России было задепонировано на патентное депонирование 10 штаммов аденовируса человека (hAdV; род Mastadenovirus, сем. Adenoviridae) и 16 штаммов респираторно-синцитиального вируса (hRSV; род Orthopneumovirus, сем. Pneumoviridae) ( Проведена оптимизация методологии подготовка образцов к метагеномному секвенированию вирома. Изучив имеющиеся в литературе данные, были выбраны для сравнения два протокола подготовки проб к секвенированию вирома: протокол, разработанный бельгийскими исследователями (NetoVIR - Novel enrichment technique of VIRomes) и протокол, предложенный научным коллективом из Китая (для краткости обозначим здесь и далее как «ChVir»). Для осуществления заявленной цели было решено объединить два протокола. Обогащение вирус-подобными частицами будет производится по бельгийскому протоколу «NetoVIR», а обратная трнскрипция, полногеномная амплификация и очистки ампликонов – по китайскому протоколу «ChVir». Итоговый протокол, реализуемый в данном исследовании, представлен в приложении. Согласно основной гипотезе проекта, было необходимо выполнить следующие задачи:  установить состав вирома для контрольной группы образцов от пациентов без клинических симптомов и отрицательных в ПЦР  сравнить соотношение компонентов вирома в пробах с уточненным с помощью ПЦР возбудителем ОРВИ и его возможное влияние на вирусное сообщество  установить разнообразие и представленность вирусов в пробах, полученных от пациентов с симптомами ОРВИ и отрицательных в ПЦР. Для реализации поставленных задач все пробы были выбраны из разных возрастных групп: 0-2 года, 3-6 лет и 7-17 лет (таблица 6). Для определения базового «ландшафта» респираторного тракта были получены пробы от здоровых детей в каждой возрастной группе. Для определения влияния известных респираторных вирусов были взяты пробы от пациентов с симптомами и диагностированным возбудителем ОРВИ (в виде моно- или ко-инфекции). И для проверки предположения о влиянии неизвестных вирусов в составе вирома на возникновение заболевания у людей с не выявленными возбудителями, были выбраны пробы от пациентов с симптомами, но отрицательными в ПЦР на 9 основных респираторных вирусов. В проекте было заявлено объединение в пулы 10 проб из каждой возрастной группы, однако ещё раз повторно изучив имеющуюся в литературе и базах данных информацию, было решено определять вирусное разнообразие для каждой пробы отдельно. Это связано с уникальностью информации о составе вирома респираторного тракта человека при различных диагностированных инфекциях, необходимых для анализа корреляций между выявленным возбудителем ОРВИ и составом вирома. Проведен анализ метагеномных данных для четырех полученных образцов вирома респираторного тракта человека. Для исследования использовали образцы от пациентов — материал мазка из глотки и носа. Образцы E1, E2, E4 были положительны на qPCR по основным вирусным и бактериальным патогенам, вызывающим респираторные инфекции. В образце E3 методом qPCR не было обнаружено нуклеиновых кислот патогенов, поэтому он использовался в качестве отрицательного контрольного образца. По результатам секвенирования и удаления фрагментов низкого качества было получено более 1 млн парных прочтений для образцов Е1, Е2, Е3 и Е4. По результатам метагеномной сборки, кластеризации и фильтрации, и оценки относительного богатства сделан вывод о том, что протокол вирусного обогащения эффективен и существенно увеличивает долю вирусных нуклеиновых кислот в образце. В образце Е3, отрицательном на основные искомые инфекции, 50 % всех вирусных контигов принадлежали Анелловирусам. Это согласуется с основной гипотезой проекта, при дальнейшем изучении может стать основным аргументом в ее пользу. В связи с этим на первом этапе мы детально фокусировались на исследовании разнообразия вирусов из семейства Anelloviridae у детей с симптомами респираторных инфекций – что является наиболее важной составляющей для проверки гипотезы проекта. Анелловирусы были обнаружены в трех из четырех отсеквенированных образцов. Отрицательному на тестируемые инфекции образцу E3, принадлежит наибольшее количество контигов Anelloviridae по сравнению с положительными образцами (χ2 = 31,9, p < 0,001). Несмотря на отсутствие респираторных патогенов, у данного пациента выявлена пневмония и наблюдаются симптомы респираторных инфекций, такие как лихорадка, высокая температура 40,3°С, недомогание, заложенность носа, кашель. Также у пациентов обнаружена обратная сильная связь между количеством найденных контигов Anelloviridae и наличием респираторных патогенов (V = 0,74, p < 0,001). Есть основания предполагать, что вирусы семейства Anelloviridae также способны вносить свой вклад в развитие респираторных заболеваний. Для отрицательного образца наблюдалось высокое видовое разнообразие анелловирусов, что может указывать на потенциальный вклад многообразия Anelloviridae в развитие респираторных симптомов у пациента. Таким образом, все запланированные на этапе работы, успешно выполнены. Впервые получены уникальные метагеномные данные, отработаны все протоколы для дальнейшей успешной реализации проекта. Все результаты по проекту опубликованы, либо отправлены в печать. Работа имеет огромное практическое значение для здравоохранения, для оптимизации мероприятий по контролю респираторных инфекций.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Общая схема работ в продлении проекта осталась неизменной, с включением дополнительных методов. Дополнительно собран и проанализирован материал для изучения нового патогена в структуре сезонных ОРВИ - SARS-CoV-2. Дополнительной важной составляющей проекта явилось применение метагеномного анализа респираторного корового вирома пациентов, включенных в исследование. В соответствии с планом работ в течение первого года выполнения проекта была проведена работа по организации сбора клинического материала у пациентов с респираторной симптоматикой для выявления основных респираторных вирусов человека, а также для оценки респираторного вирома. За период с сентября 2023 г. по апрель 2024 г. было собрано 1354 образца клинического материала (мазки из носа и зева) от детей в возрасте от 1 месяца до 17 лет. Помимо пациентов с ОРВИ в исследование вирома были включены клинически здоровые пациенты всех возрастных групп. Хотя бы один из респираторных вирусов был выявлен в 839/1354 (62%) образцах с наименьшим уровнем детекции в возрастной группе 7 – 17 лет (43,8%), что было достоверно меньше, чем у детей 0 – 2 лет (67,8%, χ2=48,86, p<0.05) и 3 – 6 лет (62,7%, χ2=20,05, p<0.05). Вирусная ко-инфекция выявлена у 119/1354 (8,8%) детей, причем частота встречаемости вирусной ко-инфекции также была достоверно ниже у детей 7 – 17 лет (2,6%) по сравнению с детьми 0 – 2 лет (11,1%, χ2=17,7, p<0.05) и 3 – 6 лет (8,3%, χ2=8,46, p<0.05). Чаще всего в исследуемый период у госпитализированных детей встречался респираторно-синцитиальный вирус, который был выявлен в 17% случаев. Кроме того, у 10,6% детей был выявлен бокавирус, что было значительно чаще, чем в предыдущие сезоны (2019 – 2022 гг.), когда он выявлялся в среднем в 5% случаев (Kurskaya et al., 2023). Вирус гриппа также был выявлен у 10,6% детей. Остальные респираторные вирусы выявлялись менее чем в 10% случаев. Вирус SARS-CoV-2 был выявлен у 7,1% пациентов, что было достоверно чаще, чем в предыдущем сезоне (2,8%, χ2=22,47, p<0.05). Вирус SARS-CoV-2 достоверно чаще выявляли у детей в возрастной группе 0 – 2 года (9,9%) по сравнению с детьми 3 – 6 лет (2,4%, χ2 = 16,37, p<0.05) и 7 – 17 лет (3,7%, χ2 = 9,89, p<0.05). Метапневмовирус достоверно чаще встречался у детей 3 – 6 лет (9,6%) по сравнению с детьми 0 – 2 лет (4,6%, χ2 = 9,47, p<0.05) и 7 – 17 лет (1,9%, χ2 = 15,11, p<0.05). Бокавирус достоверно чаще выявляли у детей младше 7 лет по сравнению с детьми школьного возраста - 11,9% и 5,2%, соответственно (χ2 = 9,98, p<0.05). Частота выявления риновируса достоверно различалась только между возрастными группами 0 – 2 лет и 7 – 17 лет – 8,7% и 4,9%, соответственно (χ2 = 4,05, p<0.05). Уровень детекции вируса парагриппа в возрастных группах 0 – 2 лет и 3 – 6 лет достоверно не отличался (3,4 % и 2,7%, соответственно), в то время как у детей 7 – 17 лет он был значимо ниже (0,4%). Кроме того, в 2023 – 2024 гг. наблюдалась более значимая, по сравнению с предыдущими сезонами, активность бокавируса: в октябре и ноябре 2023 г. уровень его выявления был около 19%, после чего частота детекции значительно уменьшилась. Максимальная активность риновируса наблюдалась в ноябре 2023 г. и составила 14,4%. Уровень выявления вирусов парагриппа значительно увеличился в апреле 2024 г. (до 13,5%). Аналогичную картину мы наблюдали и в предыдущем сезоне. Максимальный уровень выявления метапневмовируса наблюдали в марте 2024 г. (15,2%), в отличие от предыдущего сезона, когда пик активности пришелся на ноябрь 2022 г., составив 12,5%. При этом осенью 2024 г. частота выявления метапневмовируса была на уровне 0,4%. и сезонных коронавирусов отмечался в ноябре 2022 г., составив 12,5%. Уровень выявления SARS-CoV2 в течение всего сезона был выше, чем в сезоне 2022 – 2023 гг. Максимальный уровень выявления пришелся на ноябрь 2023 г., составив 13,1%. Так как основной проект был посвящен актуальной теме разнообразия респираторно-синцитиального вируса, работы были продолжены. Всего было выявлено 230 образцов клинического материала, положительных в ПЦР на респираторно-синцитиальный вирус человека. Для выделения штаммов респираторно-синцитиального вируса на клетках были отобраны образцы, в которых по результатам ПЦР значения ct не превышали 30 циклов. Так как при значениях циклов по ПЦР выше 30 количество генетического материала мало для наработки вирусных штаммов. Для наработки на культурах клеток были отобраны 105 клинических образцов. Были протестированы культуры клеток HEp-2 и Сасо-2 выявлена их пригодность для выделения и наработки штаммов респираторно-синцитиального вируса человека. По итогам анализа этиологической структуры респираторных вирусных инфекций у детей в течение трех эпидемических сезонов с фокусом на разнообразие респираторного аденовируса человека опубликована статья в «Viruses». Проведена дальнейшая оптимизация протокола метагеномных исследований индивидуальных респираторных образцов. Во время первого года Проекта мы столкнулись с методологической проблемой: для большинства образцов процесс лигирования адаптеров прошёл не в полной мере, что привело к низкой концентрации целевых библиотек и к снижению количества ридов. Мы оптимизировали протокол с реактивами на основе работы транспозазы при подготовке библиотек. Проведена дальнейшая характеризация индивидуальных образцов, для которых уже удалось провели их индивидуальное метагеномное секвенирование. Мы обнаружили вирусные контиги, относящиеся к различным вирусным семействам. Впервые детектированы и предварительно описаны новые вирусы респираторного тракта человека. В данном этапе мы детально фокусируемся на исследовании разнообразия вирусов из семейства Anelloviridae у детей с симптомами респираторных инфекций – что является наиболее важной составляющей для проверки гипотезы проекта. В ходе проекта было обнаружено 22 последовательности Анелловирусов, относящихся к трем родам. С последовательностями анелловирусов длиннее 2000 нт был проведен филогенетический анализ. Мы построили финальное дерево из всех выявленных последовательностей .По результатам которого, можно сделать вывод, что последовательности демонстрировали высокую степень разнообразия. Ограничением исследования и использования результатов является тот факт, что в связи с низким количеством ридов у образцов (Е6-Е13) сложно делать выводы о богатстве анелловирусов, а также представленности тех или иных родов анелловирусов среди индивидуальных виромов. Однако, можно предположить, что анелловирусы присутствуют в большинстве образцов и не имеют достоверной связи с возникновением респираторных симптомов или ассоциации тех или иных родов с определенными возрастными группами. По итогам анализа анелловирусов подготовлена и отправлена статья Genetic Characteristics of Anelloviruses Detected in Individual Viromes of Children with Acute Respiratory Infection Using the Metagenomic Approach в «Viruses». К сожалению, на момент подписания отчета она еще не принята, прошла второй раунд рецензирования. Таким образом, можно сделать следующее основное заключение по проверке гипотезы проекта. Полученные результаты анализа выявленных компонентов корового вирома не позволяют однозначно определить их конкретного влияния на структуру ОРВИ и клинические признаки ОРВИ у пациентов с отсутствием основных известных респираторных вирусов. Аннотация и комплексный анализ разнообразия анелловирусов человека- основного компонента корового виром не выявила его главную роль в формировании ОРВИ. В связи с чрезвычайным генетическим разнообразием семейства Anelloviridae, их исследованной выборки недостаточно для однозначных выводов, однако мы наблюдали тенденцию к большему разнообразию и количеству анелловирусов в образцах с отсутствующими основными респираторными вирусами. Обнаружены ограничения для тестирования гипотезы. Таким образом, впервые получены уникальные метагеномные данные по респираторному вирому, отработаны все протоколы для дальнейшей успешной реализации метагеномных исследований респираторного вирома человека. Основные результаты по проекту опубликованы, либо отправлены в печать. Работа имеет огромное практическое значение для здравоохранения, для оптимизации мероприятий по контролю респираторных инфекций.