Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Общая схема работ в продлении проекта осталась неизменной, с включением дополнительных методов. Дополнительно собран и проанализирован материал для изучения нового патогена в структуре сезонных ОРВИ - SARS-CoV-2. Дополнительной важной составляющей проекта явилось применение метагеномного анализа респираторного корового вирома пациентов, включенных в исследование. В соответствии с планом работ в течение первого года выполнения проекта была проведена работа по организации сбора клинического материала у пациентов с респираторной симптоматикой для выявления основных респираторных вирусов человека, а также для оценки респираторного вирома. За период с октября 2022 г. по апрель 2023 г. было собрано 1074 образца клинического материала (мазки из носа и зева) от детей в возрасте от 1 месяца до 17 лет. При этом 612/1074 (57%) образцов было получено от мальчиков и 462/1074 (43%) образца получено от девочек. 59,3% (637/1074) образцов приходилось на возраст 0 – 2 лет, 25,6% (275/1074) – 3-6 лет, 15,1% (162/1074) – 7-17 лет. В собранном клиническом материале выявляли генетический материал респираторных вирусов, включая орто- (hRsv) и метапневмовирусы (hMpv) человека, а также вирусы гриппа (hIfv) А и В, риновирус (hRv), вирусы парагриппа (hPiv), коронавирусы человека (hCov) – OC43, 229E, NL63, HKU1, аденовирус (hAdv) и бокавирус (hBov), а также новый коронавирус SARS-CoV2. В структуре ОРВИ у детей в 2022 – 2023 гг. преобладали респираторно-синцитиальный вирус и вирус гриппа, которые были выявлены в 17,5% и 15,4% образцов, соответственно. Риновирус был выявлен у 10,6% детей. Остальные респираторные вирусы выявлялись менее чем в 10% случаев. Вирус SARS-CoV-2 был выявлен у 2,8% пациентов. Этиологическая структура ОРВИ у детей г. Новосибирска в 2022 – 2023 гг. представлена на рисунке 4. Был проведен сравнительный статистический анализ частоты моно- и коинфекций у различных вирусов.0,003), hPiv (AR = 1,95, p = 0,051) над моноинфекциями соответствующих вирусов. По итогам анализа этиологической структуры респираторных вирусных инфекций у детей в течение трех эпидемических сезонов и влияния пандемии нового коронавируса на распространение респираторных вирусов опубликована статья в «Viruses». В течение сезона 2022 – 2023 гг. было выявлено 188 образцов клинического материала, положительных на респираторно-синцитиальный вирус человека. Создана коллекция штаммов респираторно-синцитиального вируса человека. В Государственную коллекцию вирусов гриппа и ОРЗ, ФГБНУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева" Минздрава России было задепонировано на патентное депонирование 10 штаммов аденовируса человека (hAdV; род Mastadenovirus, сем. Adenoviridae) и 16 штаммов респираторно-синцитиального вируса (hRSV; род Orthopneumovirus, сем. Pneumoviridae) ( Проведена оптимизация методологии подготовка образцов к метагеномному секвенированию вирома. Изучив имеющиеся в литературе данные, были выбраны для сравнения два протокола подготовки проб к секвенированию вирома: протокол, разработанный бельгийскими исследователями (NetoVIR - Novel enrichment technique of VIRomes) и протокол, предложенный научным коллективом из Китая (для краткости обозначим здесь и далее как «ChVir»). Для осуществления заявленной цели было решено объединить два протокола. Обогащение вирус-подобными частицами будет производится по бельгийскому протоколу «NetoVIR», а обратная трнскрипция, полногеномная амплификация и очистки ампликонов – по китайскому протоколу «ChVir». Итоговый протокол, реализуемый в данном исследовании, представлен в приложении. Согласно основной гипотезе проекта, было необходимо выполнить следующие задачи:  установить состав вирома для контрольной группы образцов от пациентов без клинических симптомов и отрицательных в ПЦР  сравнить соотношение компонентов вирома в пробах с уточненным с помощью ПЦР возбудителем ОРВИ и его возможное влияние на вирусное сообщество  установить разнообразие и представленность вирусов в пробах, полученных от пациентов с симптомами ОРВИ и отрицательных в ПЦР. Для реализации поставленных задач все пробы были выбраны из разных возрастных групп: 0-2 года, 3-6 лет и 7-17 лет (таблица 6). Для определения базового «ландшафта» респираторного тракта были получены пробы от здоровых детей в каждой возрастной группе. Для определения влияния известных респираторных вирусов были взяты пробы от пациентов с симптомами и диагностированным возбудителем ОРВИ (в виде моно- или ко-инфекции). И для проверки предположения о влиянии неизвестных вирусов в составе вирома на возникновение заболевания у людей с не выявленными возбудителями, были выбраны пробы от пациентов с симптомами, но отрицательными в ПЦР на 9 основных респираторных вирусов. В проекте было заявлено объединение в пулы 10 проб из каждой возрастной группы, однако ещё раз повторно изучив имеющуюся в литературе и базах данных информацию, было решено определять вирусное разнообразие для каждой пробы отдельно. Это связано с уникальностью информации о составе вирома респираторного тракта человека при различных диагностированных инфекциях, необходимых для анализа корреляций между выявленным возбудителем ОРВИ и составом вирома. Проведен анализ метагеномных данных для четырех полученных образцов вирома респираторного тракта человека. Для исследования использовали образцы от пациентов — материал мазка из глотки и носа. Образцы E1, E2, E4 были положительны на qPCR по основным вирусным и бактериальным патогенам, вызывающим респираторные инфекции. В образце E3 методом qPCR не было обнаружено нуклеиновых кислот патогенов, поэтому он использовался в качестве отрицательного контрольного образца. По результатам секвенирования и удаления фрагментов низкого качества было получено более 1 млн парных прочтений для образцов Е1, Е2, Е3 и Е4. По результатам метагеномной сборки, кластеризации и фильтрации, и оценки относительного богатства сделан вывод о том, что протокол вирусного обогащения эффективен и существенно увеличивает долю вирусных нуклеиновых кислот в образце. В образце Е3, отрицательном на основные искомые инфекции, 50 % всех вирусных контигов принадлежали Анелловирусам. Это согласуется с основной гипотезой проекта, при дальнейшем изучении может стать основным аргументом в ее пользу. В связи с этим на первом этапе мы детально фокусировались на исследовании разнообразия вирусов из семейства Anelloviridae у детей с симптомами респираторных инфекций – что является наиболее важной составляющей для проверки гипотезы проекта. Анелловирусы были обнаружены в трех из четырех отсеквенированных образцов. Отрицательному на тестируемые инфекции образцу E3, принадлежит наибольшее количество контигов Anelloviridae по сравнению с положительными образцами (χ2 = 31,9, p < 0,001). Несмотря на отсутствие респираторных патогенов, у данного пациента выявлена пневмония и наблюдаются симптомы респираторных инфекций, такие как лихорадка, высокая температура 40,3°С, недомогание, заложенность носа, кашель. Также у пациентов обнаружена обратная сильная связь между количеством найденных контигов Anelloviridae и наличием респираторных патогенов (V = 0,74, p < 0,001). Есть основания предполагать, что вирусы семейства Anelloviridae также способны вносить свой вклад в развитие респираторных заболеваний. Для отрицательного образца наблюдалось высокое видовое разнообразие анелловирусов, что может указывать на потенциальный вклад многообразия Anelloviridae в развитие респираторных симптомов у пациента. Таким образом, все запланированные на этапе работы, успешно выполнены. Впервые получены уникальные метагеномные данные, отработаны все протоколы для дальнейшей успешной реализации проекта. Все результаты по проекту опубликованы, либо отправлены в печать. Работа имеет огромное практическое значение для здравоохранения, для оптимизации мероприятий по контролю респираторных инфекций.