КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-75-00025
НазваниеРазработка иммуноанализов для определения С-реактивного белка с использованием нанозимов берлинской лазури
РуководительНикитина Мария Дмитриевна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук, Пермский край
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2022 - 06.2024 |
Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-109 - Клиническая лабораторная диагностика и нанотехнологии в медицине
Ключевые словаНанозимы берлинской лазури, иммуноанализ, С-реактивный белок, иммунофильтрация, пероксидазоподобная специфическая активность
Код ГРНТИ76.13.23
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Научная проблема, на решение которой направлен проект
Разработка технологических подходов к конструированию колориметрических иммуноанализов с использованием диагностических реагентов на основе нанозимов берлинской лазури. Нанозимами называют искусственно синтезированные наноматериалы, которые способны имитировать каталитическую активность ферментов. В частности, нанозимы берлинской лазури являются миметиками фермента пероксидазы хрена. Данный фермент наиболее часто используется в качестве цветной метки в тест-системах, например, в иммуноферментном анализе. Нанозимы берлинской лазури представляют большую привлекательность как альтернатива пероксидазе хрена ввиду простоты и низкой стоимости их синтеза, стабильности и высокой каталитической активности.
Однако на сегодняшний день для реального практического применения нанозимов берлинской лазури в конструировании коммерческих тест-систем недостаточно исследований, в которых были бы описаны примеры их применения для определения конкретных мишеней.
Решение описанной проблемы
Данную проблему можно решить путем проведения исследований, направленных на изучение применимости нанозимов берлинской лазури для определения конкретных мишеней. Мы планируем синтезировать диагностические реагенты на основе нанозимов берлинской лазури и разработать на их основе колориметрические иммуноанализы в двух форматах: иммуноанализ в лунках планшета (аналог иммуноферментного анализа) и иммуноанализ для экспресс-диагностики - иммунофильтрационный анализ с использованием нанозимов берлинской лазури. В качестве мишени будет выступать С-реактивный белок. Данный белок является одним из общепринятых маркеров воспаления и традиционной модельной мишенью для конструирования иммуноанализов. В ходе реализации проекта будут синтезированы подобраны оптимальные условия процедуры разработанных анализов, проведена оценка основных аналитических характеристик (аналитическая специфичность, воспроизводимость, точность), выявлены технологические трудности, с которыми могут столкнуться разработчики при конструировании подобных тест-систем.
Преимущества создания метода диагностики в формате, подобном иммуноферментному анализу: высокая аналитическая чувствительность и специфичность, высокий уровень воспроизводимости и точности ввиду автоматизации процедуры, наличие сертифицированного для использования в медицинских целях оборудования .
Преимуществами анализа, создаваемого в формате иммунофильтрации, являются: простота исполнения, высокая скорость получения результата, отсутствие хук-эффекта (в сравнении с более традиционным методом экспресс диагностики -иммунохроматографией), экономичность, отсутствие необходимости специализированного оборудования и высококвалифицированного персонала.
Следует отметить, что применение нанозимов берлинской лазури в качестве диагностических реагентов позволит использовать следующие их преимущества: 1) Дешевизна; 2) Высокая стабильность; 3) Высокая каталитическая активность; 4) Воспроизводимость синтеза; 5) Безопасность для человека, окружающей среды и простота утилизации.
Все вышеперечисленное позволит оценить возможности применения наночастиц берлинской лазури в качестве альтернативы ферментным диагностикумам как для традиционных лабораторных методов, так и для экспресс-диагностики (“point-of care” диагностика).
Что конкретно будет сделано в ходе реализации проекта:
Будут определены оптимальные условия получения диагностических реагентов на основе наночастиц берлинской лазури, а именно процесс функционализации их поверхности моноклональными антителами против С-реактивного белка;
Будет проведена оценка воспроизводимости синтеза, масштабируемости и стабильности при хранении полученных диагностических реагентов;
На основе полученных реагентов будут сконструированы колориметрический иммуноанализ в лунках планшета и иммунофильтрационный анализ для определения С-реактивного белка;
Для каждой тест-системы будет оптимизирована процедура анализа и проведена оценка основных аналитических характеристик (аналитическая чувствительность, воспроизводимость, точность).
Новизна
Новизна представляемого исследования обуславливается тем, что в работе будут использованы наночастицы берлинской лазури, синтезированные методом отличающегося от традиционного. Предлагаемый метод синтеза заключается в восстановлении смеси солей трехвалентного железа при помощи перекиси водорода. В исследованиях научной группы Аркадия Карякина и в наших предыдущих исследованиях, показано, что данный способ позволяет получать нанозимы с более высокой каталитической активностью. Высокоэффективные нанозимы на основе берлинской лазури еще не были применены в конструировании колориметрических иммуноанализов.
Ожидаемые результаты
1) Будут получены диагностические реагенты на основе нанозимов берлинской лазури, функционализированных моноклональными антителами против С-реактивного белка:
а) будет оптимизирован процесс модификации поверхности нанозимов берлинской лазури молекулами белка (будут использованы желатин А и бычий сывороточный альбумин);
б) будет оптимизирован процесс функционализации нанозимов берлинской лазури моноклональными антитела против С-реактивного белка;
в) будут выявлены условия масштабирования синтеза конъюгатов наночастиц берлинской лазури с моноклональными антителами против С-реактивного белка и его воспроизводимость;
г) будут оптимизированы условия хранения полученных диагностических реагентов.
2) На основе полученных диагностических реагентов будут сконструированы колориметрические иммуноанализы для определения С-реактивного белка в двух форматах - иммуноанализ в лунках планшета и иммунофильтрационный анализ:
а) будут подобраны оптимальные условия их процедуры;
б )будут оценены их основные аналитические характеристики (аналитическая чувствительность, воспроизводимость, точность).
Соответствие результатов мировому уровню:
Соответствие результатов мировому уровню определяется свойствами нанозимов. Сложность структуры и состава нанозимов, в том числе миметиков пероксидазы хрена, определяет повышенный интерес научного сообщества к углубленному изучению их активных центров, что помогло лучше понять механизмы получения таких реагентов. Все это привело к созданию нанозимов (одноатомные нанозимы, нанозимы на основе металл-органических каркасных структур, нанозимы на основе наночастиц берлинской лазури и т.д.) с повышенными в сравнении с пероксидазой хрена каталитической активностью и специфичностью по отношению к субстрату [Jin, 2022; Shen, 2022; Yan, 2021; ]. Например, в работе [Xi, 2021] описаны нанозимы на основе никель-платиновых наночастиц с пероксидазоподобной активностью, превышающую каталитическую активность пероксидазы хрена в тысячи раз. При помощью разработанных нанозимов удалось определить онкоэмбриональный антиген с нижним пределом детекции 1.1 пг/мл, что в сотни раз ниже традиционного иммуноферментного анализа [Xi, 2021].
Вышеперечисленное позволяет успешно создавать анализы для разнообразных мишеней. На основе миметиков пероксидазы хрена конструируются тест-системы для детекции ионов тяжелых металлов [Tseng, 2012; Lien, 2014; Serebrennikova, 2021] антибиотиков [Zhao, 2017], ДНК [Chau, 2016], глюкозы [Jv, 2010], простатспецифического антигена [Kim, 2017], бактерий [Panferov, 2021], вируса гриппа [Ahmed, 2016] и поверхностного антигена вируса гепатита и т.д. [Huang, 2019]. Также известно, что нанозимы берлинской лазури использовались в исследованиях, посвященных созданию методов определения глутатиона [Ma, 2019], глюкозы Zhang, 2014], человеческого сывороточного альбумина [Farka, 2018], гликохолевой кислоты [He, 2020].
Необходимо отметить перспективность применения нанозимов не только в области создания аналитических методов, но и в биомедицине и очистке окружающей среды от загрязнений.
Возможность практического использования результатов:
Полученные данные об оптимальных условия процедуры разрабатываемых анализов, их чувствительности, воспроизводимости, точности позволят оценить перспективы их трансляции в практику, выявить технологические сложности конструирования таких анализов, которые нужно усовершенствовать, и сформулировать предположения о способах такого совершенствования.
Следует отметить, что полученные результаты могут быть использованы для создания усовершенствованных тест-систем для одновременного определения нескольких маркеров воспаления (прокальцитонин, IL-6 и т.д.) и аналогичных тест-систем для определения других биологических маркеров.
Таким образом, данные, полученные в ходе реализации представляемого исследования, позволят расширить теоретическую базу, необходимую для успешного практического внедрения нанозимов берлинской лазури.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ahmed, S.R., Kim, J., Suzuki, T et al. Enhanced catalytic activity of gold nanoparticle-carbon nanotube hybrids for influenza virus detection. 2016. Biosens. Bioelectron. 85. 503–508. DOI:10.1016/j.bios.2016.05. 050
2. Chau, L.Y. et al. Platinum nanoparticles on reduced graphene oxide as peroxidase mimetics for the colorimetric detection of specific DNA sequence. J. Mater. Chem. B 2016. 4(23). 4076–4083. DOI: 10.1039/c6tb00741d
3. Farka, Z. et al. Prussian Blue Nanoparticles as a Catalytic Label in a Sandwich Nanozyme-Linked Immunosorbent Assay. Analytical Chemistry. 2018 90(3). 2348–2354. DOI:10.1021/acs.analchem.7b04883
4. He, Q. et al., Prussian blue nanoparticles with peroxidase-mimicking properties in a dual immunoassays for glycocholic acid. 2020. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Volume 187.113317. DOI: 10.1016/j.jpba.2020.113317
5. Huang, L. et al. A colorimetric paper sensor based on the domino reaction of acetylcholinesterase and degradable Γ-MnOOH nanozyme for sensitive detection of organophosphorus pesticides. 2019. Sens. Actuators B Chem. 290. 573–580. DOI: 10.1016/j.snb.2019.04.02
6. Ji, S., Jiang, B., Hao, H. et al. Matching the kinetics of natural enzymes with a single-atom iron nanozyme. 2021. Nat Catal. 4. 407–417. DOI: 10.1038/s41929-021-00609-x
7. Jin, H. et al. Perspective for Single Atom Nanozymes Based Sensors: Advanced Materials, Sensing Mechanism, Selectivity Regulation, and Applications. 2022. Anal. Chem.94. 3. 1499–1509. DOI:10.1021/acs.analchem.1c04496
8. Jv Y., Li, B., Cao. R. Positively-charged gold nanoparticles as peroxidiase mimic and their application in hydrogen peroxide and glucose detection. Chem. Commun. 2010. 46(42). 8017–8019. DOI:10.1039/c0cc02698k
9. Kim, M.S., Kweon, S.H., et al. Pt-decorated magnetic nanozymes for facile and sensitive point-of-care bioassay. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2017. 9(40). 35133–35140. DOI: 10.1021/a csami.7b12326
10. Lien, C.W. et al. Logic control of enzyme-like gold nanoparticles for selective detection of lead and mercury ions. 2014. Anal. Chem. 86(4). 2065–2072. DOI:10.1021/ac4036789
11. Panferov, V.G., Safenkova, I.V., Zherdev, A.V., Dzantiev, B.B. Urchin peroxidase-mimicking Au@Pt nanoparticles as a label in lateral flow immunoassay: impact of nanoparticle composition on detection limit of Clavibacter michiganensis (2020) Microchimica Acta, 187 (5), DOI: 10.1007/s00604-020-04253-3
12. Serebrennikova, K.V., Komova, N.S., Berlina, A.N., Dzantiev, B.B., Zherdev, A.V. Tannic acid-capped gold nanoparticles as a novel nanozyme for colorimetric determination of pb2+ ions (2021) Chemosensors, 9 (12), статья № 332, . DOI: 10.3390/chemosensors9120332
13. Shen, L. et al. Fe–N–C single-atom nanozymes based sensor array for dual signal selective determination of antioxidants. 2022. Biosensors and Bioelectronics Volume 205. 114097. DOI: 10.1016/j.bios.2022.114097
14. Tseng, C.W. et al. Detection of mercury ions based on mercury-induced switching of enzyme-like activity of platinum/gold nanoparticles. 2012. Nanoscale 4(21). 6823–6830. DOI: 10.1039/ c2nr31716h
15. Xi, Zh., Wei, K., Wang, Q. Nickel–Platinum Nanoparticles as Peroxidase Mimics with a Record High Catalytic Efficiency. 2021. J. Am. Chem. Soc. 143, 7. 2660–2664. DOI:10.1021/jacs.0c12605
16. Yan H. et al. Amorphous RuTe2 nanorods as efficient peroxidase mimics for colorimetric immunoassay. 2021. Sensors and Actuators B: Chemical. Volume 341. 130007. DOI: 10.1016/j.snb.2021.130007
17. Zhao, J., Wu, Y. et al. Colorimetric detection of streptomycin in milk based on peroxidase-mimicking catalytic activity of gold nanoparticles. RSC Adv. 2017. 7 (61). 38471–38478. DOI: 10.1039/c7ra06434a
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. В ходе работы было синтезировано 5 конъюгатов наночастиц берлинской лазури методом ковалентного присоединения при помощи глутарового альдегида с различными массовыми соотношениями желатина А на 1 мг наночастиц. На основании оценки коллоидной стабильности в различных растворах, сохранения структурных свойств при хранении и функциональной активности было показано, что оптимальное покрытие наночастиц берлинской лазури инертным белком желатином А происходит при их смешивании в массовом соотношении 10 мг желатина А на 1 мг наночастиц берлинской лазури.
2. В результате исследований, проведенных в первый год проекта, продемонстрировано, что добавление глутарового альдегида к смеси наночастиц берлинской лазури, покрытых инертным белком в концентрации 1.5 % в объемном соотношении 1:1 позволят определять С-реактивный белок (СРБ) в колориметрическом иммуноанализе с наибольшей эффективностью. Оптимальным массовым соотношением наночастицы берлинской лазури, активированные глутаровым альдегидом: моноклональные антитела против С-реактивного белка является 1 мг наночастиц:100 мкг моноклональных антител.
Дополнительно проведена оценка эффективности применения в разрабатываемом иммуноанализе различных пар моноклональных антител: антитела захвата, находящиеся на иммуносорбенте, и антитела на поверхности наночастиц берлинской лазури. Всего было протестировано 6 пар. Показано, что использование всех протестированных пар моноклональных антител против С-реактивного белка позволяет эффективно определять С-реактивный белок в концентрации менее 0,1 нг/мл, в то время как нормальным значением уровня СРБ по результатам иммуноферментного анализа считается 3-10 нг/мл.
3. В подобранных оптимальных условиях было синтезировано по 3 партии конъюгата наночастиц берлинской лазури с 2 различными моноклональными антителами против СРБ (клон С6сс и клон CRP135cc). Два конъюгата были синтезированы в объеме 0,5 мл, третий конъюгат получали в увеличенном масштабе в объеме 2,5 мл. Всего было получено 6 партий конъюгатов. Для каждого конъюгата была проведена оценка концентрации наночастиц берлинской лазури в составе диагностического реагента, структурных характеристик и функциональной активности методом колориметрического иммуноанализа для определения С-реактивного белка. Продемонстрировано получение диагностических реагентов на основе наночастиц берлинской лазури, функционализированных моноклональными антителами против СРБ со схожими характеристиками.
4. Показано, что масштабирование разработанного метода синтеза конъюгатов не приводит к существенным изменениям характеристик получаемых диагностических реагентов.
5. Продемонстрировано сохранение структурных свойств и функциональной активности конъюгата на основе наночастиц берлинской лазури, модифицированных моноклональными антителами против С-реактивного белка, в течение 5 месяцев хранения при +4°С в деионизированной воде. Показано, что наночастицы в составе конъюгата сохраняют свои размеры и полидисперсность. Чувствительность анализа для определения С-реактивного белка с их использованием в качестве диагностического реагента также сохраняется в течение 5 месяцев.
Публикации
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках второго года проекта впервые была представлена разработка иммуноанализа на основе нанозимов берлинской лазурри, полученных с помощью восстановления смеси солей трехвалентного железа, и оценена его эффективность. Уникальность данного исследования заключается в том, что ранее не было разработано твердофазного иммуноанализа для выявления С-реактивного белка с использованием высокоэффективных наночастиц берлинской лазури. В ходе работ проведена оптимизация процедуры представляемого аналитического метода, валидация его результатов и сравнение их со стандартным методом, чего ранее не делалось для диагностических реагентов на основе высокоэффективных нанозимов берлинской лазури. В процессе исследований определены нижний предел детекции иммуноанализа (21,8 пг/мл) и динамический диапазон (0,39–50 нг/мл). Аналитическая чувствительность анализа позволяет количественно определять СРБ в образцах сыворотки, разведенных в 1000 раз. Также продемонстрирована приемлемая точность и воспроизводимость данного метода диагностики.
В отчетный период также был сконструирован имммунофильтрационный анализ на основе высокоэффективных нанозимов берлинской лазури, синтезированных в 79,2% водном растворе этиленгликоля, что позволяет существенно снизить уровень фонового сигнала, в отличие от диагностических реагентов на основе наночастиц, синтезированных в воде. Определены оптимальные условия для проведения иммунофильтрационного анализа на основе нанозимов берлинской лазури для определения СРБ и регистрации его результатов. Нижний предел детекции разработанного иммунофильтрационного анализа составляет 100 мкг/Л. Учитывая тот факт, что для анализа сыворотку крови необходимо будет разводить в 10 раз и полученный показатель аналитической чувствительности, то разработанную иммунофильтрационную тест-систему можно будет использовать для оценки воспаления. Однако для оценки риска кардиоваскулярных заболеваний представляемый анализ не обладает достаточной чувствительностью.
Публикации
1. Мария Никитина, Павел Храмцов, Мария Бочкова, Михаил Раев Development and performance of NLISA for C-reactive protein detection based on Prussian blue nanoparticle conjugates Analytical and Bioanalytical Chemistry, 10.1007/s00216-024-05268-y (год публикации - 2024) https://doi.org/10.1007/s00216-024-05268-y
2. Павел Храмцов, Мария Кропанева, Дмитрий Кисельков, Артем Минин, Лариса Чеканова, Михаил Раев Synthesis of Prussian Blue nanoparticles in water/alcohol mixtures Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, Volume 686, 5 April 2024, 133446 (год публикации - 2024) https://doi.org/10.1016/j.colsurfa.2024.133446
Возможность практического использования результатов
Результаты проекта могут стать основой для разработки не только новой системы диагностического тестирования в форматах иммуноанализа в лунках планшета и иммунофильтрации для определения С-реактивного, но и послужить платформой для создания тест-систем для детекции практически любых биомаркеров. Полученные данные и разработанные подходы могут быть использованы в работе, как коммерческих клинических лабораторий, так и государственных медицинских учреждений.