Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках проекта из ядровой древесины маакии амурской были выделили новый изофлаваностильбен маакиапицевеститол (1), а также ряд ранее известных димерных и мономерных стильбенов: резвератрол (2), пицетаннол (3), маакин (4), сцирпусин А (5), маакиазин (6) и мааколин (7). Структура маакиапицевеститола (1) была установлена помощью методов одномерной (1H и 13С) и двумерной (COSY, HSQC, HMBC, ROESY) спектроскопии ЯМР, масс-спектрометрии высокого разрешения и спектроскопии кругового дихроизма (КД). Было установлено, что в структуру маакиапицевеститола (1) входят фрагменты веститола и пицеатаннола. Сравнение экспериментально полученных и теоретически рассчитанных констант спин-спинового взаимодействия и КД-спектров позволило определить конфигурацию асимметрических центров в молекуле маакиапицевеститола (1) как 3R,4S. Детальный анализ спектров ЯМР показал, что маакиапицевеститол (1) был выделен в виде смеси двух устойчивых конформеров 1а и 1b, конформационный переход между которыми затруднен из-за высокого энергетического барьера (ΔЕ ≥ 20 ккал/моль). Соединения 2–7 идентифицированы путем сравнения их спектров ЯМР и ВЭЖХ-МС с ранее опубликованными в литературе данными. Абсолютная конфигурация асимметрических центров в соединениях 3 и 6 была определена сравнением экспериментально полученных и теоретически рассчитанных КД-спектров как 2S,3S и 3S,3aS,8R,8aS соответственно. Методами молекулярного докинга изучено взаимодействие полифенольных соединений маакии амурской (1-7) с поверхностными гликопротеинами ВПГ-1 gD, gHgL и gB, а также с тимидинкиназой ВПГ-1. Показано, что исследуемые соединения могут связываться непосредственно с gD, конкурируя за сайты связывания этого белка с клеточным рецептором нектин-1 (3-SKU) и предотвращая адсорбцию вируса. Молекулярный докинг с поверхностным гликопротеином ВПГ-1 gHgL был выполнен в два сайта связывания антител, блокирующих образование комплекса gHgL-gB. Анализ контактов полифенолов с гликопротеином gHgL показал, что наиболее эффективное связывание наблюдалось для соединений 1-3 и 6 (табл. 5 и 6, рис. 8-13) в сайте, содержащем Glu86. Молекулярный докинг с поверхностным гликопротеином ВПГ-1 gB показал, что наиболее эффективно с этим белком связывается маакиазин (6), взаимодействуя одновременно с тремя доменами. Проведенный молекулярный докинг c тимидинкиназой ВПГ-1 показал, что мономерные стильбены резвератрол (2) и пицеатаннол (3) способны связываться с вирусной тимидинкиназой в том же сайте, что и ацикловир (рис. 16). Однако димерные стильбены такой способностью не обладали В рамках проекта была охарактеризована способность полифенольного комплекса (ПФК) маакии амурской целенаправленно воздействовать на разные этапы жизненного цикла ДНК-содержащего вируса (ВПГ-1). Наиболее высокая противовирусная активность ПФК была зарегистрирована при одновременном воздействии на клетки Vero ВПГ-1. Установлено, что механизмы, лежащие в основе противовирусного действия ПФК, связаны с блокированием прикрепления вирусов к клеткам, прямой инактивацией вирусных частиц и ингибированием ранней стадии репликации вирусов. Противовирусную активность полифенолов маакии амурской в отношении ВПГ-1 оценивали с помощью анализа ингибирования цитопатогенногтдействия вируса. На ранней стадии вирусной инфекции полифенолы добавляли к клеткам Vero одновременно с вирусом. Стильбены 1, 3–5 проявляли значительную противовирусную активность (значения ИК50 варьировали от 27 до 90 мкМ). Маакиазин (6) и мааколин (7) проявляли умеренную активность (значения ИС составили 6,6 и 6,4, а ИК50 45,0 и 88,9 соответственно). ПФК маакии амурской также эффективно ингибировал репликацию вируса (значения ИК50 и ИС составили 13,9 мкг/мл и 87 соответственно). Активность полифенольных соединений из маакии амурской против ВПГ-1 также оценивали методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Клетки Vero одновременно инфицировали ВПГ-1 и обрабатывали полифенольными соединениями в концентрациях 50 и 5 мкг/мл. После двухдневной инкубации клеток из супернатантов экстрагировали ДНК вируса и с помощью ПЦР-РВ определяли относительный уровень вирусной нагрузки по пороговому циклу реакции амплификации (Ct). Влияние тестируемых соединений на снижение содержания в образцах ДНК ВПГ-1 оценивали по изменению порогового цикла ΔCt, ИК50 и индексу селективности (ИС) соединения. Установлено, что полифенольные соединения маакии амурской значительно ингибировали репликацию ВПГ-1 в концентрации 50 мкг/мл, когда клетки Vero одновременно обрабатывали этими соединениями и инфицировали ВПГ-1. В этой концентрации соединения 1, 3–5 и ПФК снижали количество циклов амплификации в среднем на 14 циклов (ΔCt) и полностью (до 100%) ингибировали репликацию вируса. Однако в концентрации 5 мкг/мл только соединения 1, 5 и ПФК снижали относительный уровень ДНК ВПГ-1 в среднем на 30% по отношению к вирусному контролю (p < 0,05). Полученные результаты показали, что полифенольные соединения маакии амурской ингибировали инфекцию ВПГ-1 дозозависимым образом. Мы обнаружили, что соединения 1, 3–5 и ПФК маакии амурской были наиболее эффективны при их добавлении одновременно с инфицированием клеток. В рамках проекта было оценено влияние полифенолов маакии амурской на выживаемость клеток Neuro-2a после их обработки паракватом (ПВ). ПФК маакии амурской показал высокую нейропротекторную активность и повысил жизнеспособность клеток на 18% при концентрации 10 мкг/мл по сравнению с клетками Neuro-2a, обработанными ПВ. Мааколин (7) в концентрации 10 мкМ также эффективно повышал жизнеспособность обработанных ПВ клеток (на 16%). Маакиапицевеститол (1) и сцирпусин А (5) в концентрации 10 мкМ (5,1 и 4,9 мкг/мл соответственно), а также ПФК (10 мкг/мл) снижали уровень внутриклеточных АФК в клетках Neuro-2a, обработанных ПВ, на 17%, 7% и 12%. соответственно. Маакин (4) в минимальной изучаемой концентрации 0,1 мкМ ингибировал уровень АФК на 17%. Мааколин (6) не снижал уровень АФК в клетках Neuro-2a, обработанных ПВ. Изучено влияние стильбенов и ПФК маакии амурской на митохондриальный мембранный потенциал в клетках Neuro-2a, обработанных ПВ. Все исследуемые полифенолы были способны предотвращать деполяризацию и восстанавливать потенциал митохондриальной мембраны. Таким образом, в рамках проекта была охарактеризована способность ПФК маакии амурской целенаправленно воздействовать на разные этапы жизненного цикла ДНК-содержащего вируса (ВПГ-1). Показано, что антигерпетическое действие ПФК маакии амурской в значительной степени обусловлено активностью входящих в его состав полифенольных метаболитов. В рамках проекта полифенолы, обладающие антигерпетическим действием, были выделены в индивидуальном состоянии, а их структуры установлены с применением современных физико-химических методов. Противогерпетическая активность ПФК и индивидуальных полифенолов маакии амурской обусловлена их способностью, с одной стороны, взаимодействовать с поверхностными белками ВПГ-1, а с другой стороны ‒ снижать уровень внутриклеточных АФК, повышенный при герпетической инфекции.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На втором году реализации проекта из ядровой древесины маакии амурской были выделены изофлавоноиды генистеин (2), ретузин (3), маакиаин (4), текторигенин (5), медикарпин (7), формононентин (8) и (±)-3-гидроксивеститон (12), а также флавоноид ликвиритигенин (6). Были наработаны дополнительные количества мономерных стильбенов ресвератрола (1) и пицеатаннола (11), димерных стильбенов маакина (9) и сцирпусина А (13), а также изфлавоностильбенов маакиазина (10) и маакиапицевеститола (14). Для структурной идентификации выделенных полифенолов использовались методы одномерной спектроскопии ЯМР (1H и 13C ЯМР), а также хроматомасс-спектрометрия. Сравнение экспериментально полученных и теоретически рассчитанных констант спин-спинового взаимодействия и КД-спектров позволило определить конфигурацию асимметрических центров в молекулах маакиазна (10) и сцирпусина А (13) как 1''S,2''S и 7R,8R соответственно. В рамках проекта была оценена нейропротективная активность полифенолов маакии амурской на модели нейротоксичности, индуцированной 6-гидроксидофамином (6-ОГДА) и паракватом (ПК) в клетках нейробластомы мыши Neuro-2a. Ликвиритигенин (6) и сцирпусин А (13) в концентрации 10 мкМ, а также ПФК маакии амурской (10 мкг/мл) повышали жизнеспособность обработанных 6-ОГДА клеток Neuro-2a на 12%, 9% и 11%. % соответственно. С помощью флуоресцентного анализа с применением зонда DCF-DA изучено влияние полифенольных соединений из ядровой древесины маакии амурской на уровень АФК в клетках Neuro-2a, обработанных 6-ОГДА. Сцирпусин А (13), маакиазин (10) и ликвиритигенин (6) обладали высокой активностью в этом тесте и в концентрации 1 мкМ/мл снижали уровень АФК в обработанных 6- ОГДА клетках Neuro-2a на 43%, 20%, и 15% соответственно. Ресвератрол (1), хотя и не повышал выживаемость клеток Neuro-2a, обработанных 6-ОГДА, в концентрации 1 мкМ/мл снижал уровень внутриклеточных АФК на 15%. С помощью флуоресцентного зонда TMRM изучено влияние полифенольных соединений из ядровой древесины маакии амурской на митохондриальный мембранный потенциал в клетках Neuro-2a. Наблюдался значительный эффект увеличения митохондриального мембранного потенциала на 8-12%, когда клетки Neuro-2a инкубировали с ресвератролом (1), пицеатаннолом (11), ликвиритигенином (6), медикарпином (7) и маакином (9) в концентрации 10 мкМ. На втором году реализации проекта на модели нейротоксичности, индуцированной ПК, был оценен нейропротективный потенциал стильбена 1, флавоноида 6 и изофлавоноидов 2-5, 7, 12. Ресвератрол (1) и ликвиритигенин (6) в концентрации 10 мкМ продемонстрировали значительную активность и увеличили жизнеспособность клеток, обработанных ПК, на 17% и 15% соответственно. Изофлавоноиды генистеин (2), медикарпин (7) и маакиаин (4) в этой концентрации показали гораздо менее значительный эффект и увеличили жизнеспособность клеток на 5%, 7% и 2% соответственно. Ликвиритигенин (6) эффективно снижал уровень АФК в клетках Neuro-2a, обработанных ПК. Методом проточной цитометрии с использованием флуоресцентного красителя аннексина V исследовано влияние полифенольных соединений из ядровой древесины маакии амурской на апоптоз в клетках Neuro-2a, обработанных 6-ОГДА. Полифенолы 3, 6 и 13 уменьшали нейротоксический эффект от обработки клеток 6-OГДА. Эти соединения значительно увеличили процент живых клеток Neuro-2a и уменьшили количество ранних апоптотических клеток. Антигерпетическую активность полифенолов маакии амурской оценивали по ингибированию цитопатогенного действия вируса (ЦПД) с помощью МТТ-теста и методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). На втором году реализации проекта была изучена способность полифенолов 1–14 напрямую взаимодействовать с вирусными частицами (вирулицидная активность). Маакин (9) и сцирпусин А (13) ингибировали репликацию вируса более эффективно, чем другие исследуемые полифенолы (значения ИК50 составили 2,4 и 2,6 мкг/мл соответственно). Полифенольные соединения 1, 7, 10, 11, 14 также проявляли значительную противовирусную активность со значениями ИК50 в диапазоне от 6,7 до 9,6 мкг/мл. Генистеин (2) и мааккиаин (4) проявили умеренную активность (ИК50 16,7 и 28,3 мкг/мл соответственно). Методом ПЦР-РВ показано, что маакин (9) и сцирпусин А (13) в концентрации 10 мкг/мл вызывали максимальное снижение содержания вирусной ДНК среди исследуемых соединений. Соединения 10, 11 и 14 также значительно снижали уровень вирусной ДНК. Соединения 1, 2, 4 и 7 обладали умеренной вирулицидную активностью. Только соединения 9, 11 и 13 ингибировали репликацию ВПГ-1 в концентрации 1 мкг/мл. Изучение вирулицидной активности полифенольных соединений маакии амурской показало, что маакин (9) и сцирпусин А (13) проявляют наибольшую ингибирующую активность в отношении вируса ВПГ-1 среди тестируемых соединений. Однако обработка клеток Vero маакином (9) и сцирпусином А (13) перед инфицированием (предварительная обработка клеток) оказывала слабое влияние на репликацию ВПГ-1. Обработка клеток этими полифенолами после проникновения вируса в клетки (обработка инфицированных клеток) оказывало умеренный эффект на репликацию ВПГ-1. В рамках проекта методами молекулярного докинга с применением программы МОЕ 2020.09 изучено взаимодействие полифенольных соединений маакии амурской с поверхностными гликопротеинами ВПГ-1 gD, gHgL и gB, а также с вирусной тимидинкиназой. Среди изофлавоноидов и флавоноидов только соединения 2, 4, и 7 были способны связываться с gD. В отличие от стильбенов 1, 9, 10, 11, 13, 14, эти взаимодействия были слабыми и параметры докинга не превышали 1.1 ккал/моль. Эти данные коррелировали со значениями ИС и ИК50, полученными при экспериментальном изучении противовирусной активности полифенолов маакии амурской. Изофлавоноиды и флавоноиды маакии амурской не показали способности связываться с гликопротеинами gHgL, gB и вирусной тимидинкиназой. Антиоксидантные свойства стильбенов 9, 10, 11, 13, 14 были исследованы на модели неферментативного Fe2+-индуцированного окисления гомогената мозга мыши. Стильбены 9, 10, 11, 13, 14 проявили высокую антиоксидантную активность и в концентрации 10 мкМ/мл полностью ингибировали образование продуктов взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой. Таким образом, установлено, что полифенольные соединения вносят вклад в антигерпетическую и нейропротекторную активность экстракта маакии амурской. Димерные стильбены маакин (9) и сцирпусин А (13) обладали самой высокой противовирусной активностью среди исследованных полифенолов, главным образом, за счет их прямого вирулицидного действия. Это может быть обусловлено их способностью взаимодействовать с поверхностными гликопротеинами ВПГ-1. Флавоноид ликвиритигенин (6) и димерный стильбен сцирпусин А (13) проявили наиболее высокую нейропротекторную активность среди исследуемых полифенолов маакии амурской. Сцирпусин А (13) оказался наиболее перспективным соединением, так обладал как высокой антигерпетической активностью, так и нейропротекторным потенциалом.