Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения работ в 2022/23 году в рамках проекта № 22-75-10120 были установлены эффекты воздействия низкоинтенсивного излучения в красном и ближнем инфракрасном диапазонах в трехмерных клеточных структурах – сфероидах из мезенхимных стромальных клеток (МСК) слизистой оболочки десны человека. Показано, что метаболическая активность сфероидов и продукция АТФ во всех группах (контроль, облучение при длинах волн 633 нм и 840 нм) находилась на одном уровне. Однако пролиферативная активность в группе, где сфероиды облучали при 840 нм, оказалась незначительно ниже, но нормализованная на концентрацию ДНК метаболическая активность, напротив, была примерно на 10% выше, чем в других группах. Схожая тенденция отмечалась и для динамики реактивации сфероидов, которая происходила в основном за счет миграции групп клеток единым фронтом на относительно большие расстояния. Разработана гидрогелевая система с реологическими свойствами, оптимальными для осуществления экструзионной биопечати. В качестве основы нами были использованы ранее синтезированные конъюгаты ПЭГ-фибрина. С помощью реометра были получены кинетические зависимости модуля сдвига для гидрогелевых систем на их основе и оценены соответствующие значения модуля Юнга. Так, расчетные константы полимеризации составили τ = 42,75 ± 0,29, 31,26 ± 0,18, 35,09 ± 0,19 мин для нативного фибрина и конъюгатов 5:1 и 10:1, соответственно. Установлена высокая вариабельность между образцами и показано, что в отличие от измерений АСМ система на основе 5:1 ПЭГилированного фибрина была немного более жесткой, чем на основе нативного с самой низкой гетерогенностью результатов модуля Юнга: 596,74 ± 15,91 (5:1) против 490,26 ± 208,55 (нативный) и 274,93 ± 96,99 (10:1). Тест амплитудной развертки показал, что все образцы имеют одинаковое деформационное поведение. Частотный тест в области линейной вязкоупругости выявил лишь слабое увеличение модуля накопления и слабое уменьшение модуля потерь. С целью оптимизации свойств гидрогелевой системы был расширен компонентный состав и подобраны концентрации фибрина и желатина, обеспечивающие наилучшую печатуемость, а также способы сшивки для обеспечения механической прочности и стабильности при последующем культивировании. Было показано, что через 5-7 минут после добавления сшивающего агента значения модулей сохранения и потерь выходят на плато; при этом максимальные значения (модуль сохранения – около 90 Па, модуль потерь – около 18 Па) наблюдаются для образцов, подвергавшихся двойной сшивке (ферментативной и фотоиндуцируемой). Модуль Юнга поверхности конструкта составил 1,4 кПа при макро- и 0,6 кПа при наноиндентировании. Были определены характерное время релаксации и гелирования. Оптимальные параметры печати с помощью разработанной гидрогелевой системы, при которых различия между формируемом конструктом и 3D моделью были минимальны, а сходства – максимальны, составили 30-45 кПа и 22-24°С. Выявлено, что при инкапсулировании в разработанной гидрогелевой системе (смешивание и биопечать) сфероиды из МСК оставались жизнеспособны и метаболически активны. Через 7 суток появлялось большое количество отростков, клетки были жизнеспособны и активно заполняли прилегающий объем гидрогеля; через 14 суток они сохраняли жизнеспособность и мигрировали от исходного сфероида на расстояния более чем 1000 мкм. При этом клетки активно пролиферировали. В длинных отростках из сфероидов обнаруживался виментин, а также установлено наличие фибронектина и коллагена I типа – основных белков de novo синтезируемого внеклеточного матрикса, что свидетельствует о протекании начальных этапов формирования ткани в сформированном конструкте. Создан прототип портативного биопринтера «Биоган». При изготовлении деталей корпуса с помощью 3Д-принтера элементы, не испытывающие нагрузки при работе, были напечатаны с коэффициентом заполнения 15%, что позволило уменьшить вес устройства. В стенках были сделаны направляющие прямоугольного сечения, что привело к уменьшению веса и ширины устройства без потери надежности работы. Центр масс устройства смещен таким образом, чтобы он проходил через суставы, соединяющие пястные кости и проксимальные фаланги для обеспечения удобства работы. Для осуществления требуемого функционала были использованы две независимые передачи «винт-гайка» для регулируемой возможной подачи двух компонентов (например, биочернил / гидрогелевой системы / сшивающего агента). Для приведения системы в действие были выбраны шаговые двигатели. Передача крутящего момента на винт (однозаходная резьба с шагом 2 мм) осуществляется при помощи ременной системы и шкивов с передаточным отношением 1:1, что обеспечивает линейное перемещение при одном микрошаге 5 мкм, что позволяет подавать компоненты с точностью 0,5 мкл. Система управления представляет собой два драйвера шаговых двигателей, микроконтроллер ATmega328P и аналоговые ключи для управления системой, а также контролем за ее состоянием. Реализация системы облучения представляет собой отдельный блок и включает фотодиодную матрицу с тремя типами светодиодов, пики излучения которых находятся на 365, 630 и 840 нм. Расчетная область облучения без применения теневых масок и диаграфм составляет 250 мм2. Данный вариант выполнения позволяет сократить вес и габариты биопринтера, а также увеличить эффективность и скорость проведения операций за счет увеличения области облучения. В рамках реализации проекта в 2022/23 году была опубликована 1 статья в зарубежном журнале, индексируемом в Scopus и Web of Science и относящемся к Q1. Результаты работы были представлены в форме устных докладов на 2 научных мероприятиях в России и за рубежом. В 2023/24 году планируется подобрать оптимальный режим воздействия низкоинтенсивным излучением в красном и ближнем инфракрасном диапазонах для модулирования состояния клеток в сформированных с помощью биопечати трехмерных эквивалентах, оптимизировать протокол выделения нановезикул (в том числе матрикс-связанных везикул) и их комплексно охарактеризовать, разработать биочернила, содержащие клеточные сфероиды и/или нановезикулы и подходящие для использования в прототипе портативного биопринтера «Биоган», выполнить анализ их биосовместимости при подкожной имплантации у мышей. Будет опубликовано не менее 3 статей в международных журналах, индексируемых в Scopus и/или WoS. По результатам выполнения проекта будет разработан новый подход к восстановлению сложноорганизованных комплексов тканей, основанный на применении разработанных прототипа портативного биопринтера «Биоган» и биочернил, и будет опубликовано не менее 10 статей в международных журналах, индексируемых в Scopus и/или WoS.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе выполнения работ в 2023/24 году в рамках проекта №22-75-10120 был выбран оптимальный режим воздействия низкоинтенсивным излучением в красном (633 нм) и ближнем инфракрасном (840 нм) диапазонах для модулирования состояния клеток в сформированных с помощью биопечати трехмерных эквивалентах. Для этого предварительно нами было установлено влияние фотобиомодуляции (ФБМ) на жизнеспособность культуры мезенхимных стромальных клеток (МСК) при воздействии ингибиторами (нитропруссид натрия, цисплатин и ротенон) в разных концентрациях. Показано, что при низкой концентрации нитропруссида натрия (25мкМ) и цисплатина (15 мкМ) облучение клеток имело положительный эффект на их жизнеспособность, что выражалось в снижении доли клеток в стадии апоптоза; при этом для высоких концентраций (100 мкМ и 30 мкМ, соответственно) значимого эффекта выявлено не было. При воздействии ротеноном (0,1 и 0,01 мкМ) облучение в красном и ближнем инфракрасном диапазонах способствовало снижению доли клеток в раннем апоптозе примерно на 3%. Оптимизация режима ФБМ при ингибировании культуры клеток ротеноном позволила установить интенсивность излучения (2,2 Дж/см2), которая способствовала повышению жизнеспособности на 20-40% и являлась безопасной в условиях сильного стресса. Установленный режим был использован для ФБМ состояния клеток в составе напечатанных конструктов на основе сфероидов из МСК. Наиболее выраженные эффекты отмечены для группы, подвергшейся облучению при длине волны 840 нм: уже спустя 24 часа после биопечати концентрация АТФ была выше примерно на 50% по сравнению с контролем, а через 14 дней установлено повышение метаболической активности на 20%, концентрации АТФ на 60% и ДНК на 50% и миграционной активности на 20% по сравнению с контрольной группой. Был оптимизирован протокол выделения нановезикул (экзосом и матрикс-связанных везикул (МСВ)), которые были комплексно охарактеризованы (включая протеомный анализ). В частности, нами было предложено исключить стадию децеллюляризации из стандартного ранее описанного нами протокол (Peshkova et al. 2024), так как было показано, что добавление 0,5% Тритона X-100 может в том числе нарушать целостность везикул и таким образом изменять состав их белков и микроРНК. В качестве источника нановезикул нами была использована культура клеток МСК пуповины человека. По результатам морфологического анализа выявлено, что выделенные экзосомы и МСВ, полученные по стандартному и оптимизированному протоколу, не имели отличий на микрофотографиях, полученных с помощью просвечивающей электронной микроскопии, а их размере лежал в диапазоне 55-178 нм. Установлено, что белки, содержащиеся в обоих типах везикул, значительно обогащают молекулярные пути, связанные с организацией внеклеточного матрикса, транспорта малых молекул, и вовлечены в иммунные процессы. Белковый состав экзосом по сравнению с МСВ больше обогащен протеинами, связанными с фактором роста эндотелия сосудов (VEGFA) и соответствующей тирозинкиназой VEGFR2, положительной регуляцией локомоции и заживлением ран, что свидетельствует об их более высоком потенциале к индукции васкулогенеза и клеточной миграции. Были разработаны биочернила, содержащие клеточные сфероиды и нановезикулы и подходящие для использования в прототипе портативного биопринтера «Биоган». Для их формирования нами была использована гидрогелевая система на основе фибрина и желатина, разработанная в рамках первого года выполнения проекта, трехдневные сфероиды из МСК и экзосомы. Показано, что введение экзосом в концентрации 50 мкг/мл в состав биочернил способствовало увеличению миграционной активности клеток и формированию более разветвленной сети отростков на 4-й день культивирования. При визуализации экзосом путем флуоресцентного мечения красителем PKH26 отмечено, их равномерное распределение в толще гидрогеля, а также выявлена способность МСК к их поглощению. Клетки в составе конструктов, сформированных с использованием биочернил с и без экзосом, сохраняли высокий уровень жизнеспособности. Анализ реологических свойств в эксплуатационных условиях показал, что вязкость материала сильно зависит от температуры и скачкообразно меняется при остывании, что выявило необходимость предусмотрения в конструкции биопринтера возможности термостатирования картриджей с компонентами биочернил и смесителя. Была установлена биосовместимость разработанных биочернил при подкожной имплантации у мышей BALB/c nude. Нами было сформировано 4 группы животных (n=6 в каждой группе), которым было имплантировано 4 типа имплантов: разработанная гидрогелевая система, биочернила (гидрогелевая система со сфероидами), бесклеточный эквивалент (конструкт, напечатанный с использованием гидрогелевой системы без клеток и содержащий коллагеновую мембрану), биоэквивалент (конструкт, напечатанный с использованием биочернил (гидрогелевая система с клетками) и содержащий коллагеновую мембрану). Показано, что через 7 суток после имплантации в группе «Гидрогелевая система» присутствует выраженный папилломатоз, высокая лимфо-макрофагальная инфильтрация и большое количество тучных клеток. Присутствие сфероидов в составе биочернил оказывало положительный эффект, немного снижая лимфо-макрофагальную инфильтрацию и содержание тучных клеток, а также способствуя проникновению иммунных клеток в толщу имплантата и улучшая его резорбцию. Лучшие результаты были выявлены для групп «Бесклеточный эквивалент» и «Биоэквивалент», так как в обеих группах наблюдалось снижение выраженности папилломатоза, уровня лимфо-макрофагальной инфильтрации (лучше в первой случае) и содержания тучных клеток (лучше во втором случае); при этом отмечалась хорошая резорбция: имплантаты были разрыхлены и разволокнены, а в их толще выявлялись многочисленные очаги иммунных клеток. Через 14 суток во всех группах отмечалось снижение выраженности папилломатоза, лимфо-макрофагальной инфильтрации и содержания тучных клеток, а также усиливалась резорбция имплантатов с появлением множественных очагов иммунных клеток в их толще. Лучшие результаты были отмечены для группы «Биоэквивалент», в которой по сравнению с другими обнаруживалась самая слабая воспалительная инфильтрация и самая значимая резорбция имплантата. Анализ МР-томограмм животных на 7-е и 21-е сутки после имплантации подтвердил присутствие резорбтивного процесса, преобладающего в группах, где импланты содержали клеточные сфероиды. С целью оптимизации конструкции прототипа биопринтера нами были рассмотрены свойства и методы получения различных эластомерных матриц, подходящих для изготовления электроактивных полимерных актуаторов, использование которых потенциально способно снизить массу конечного изделия, что будет являться существенным достижением при создании устройства для нанесения биочернил на поверхность ран. В рамках реализации проекта в 2023/2024 году было опубликовано 3 статьи в зарубежных журналах, индексируемых в Scopus и Web of Science и относящихся к Q1-Q2. Результаты работы были представлены в форме устных и стендовых докладов на 3 научных мероприятиях. В 2024/25 году планируется оптимизировать конструкцию прототипа портативного биопринтера «Биоган» с учетом свойств разработанных биочернил и установленного оптимального режима воздействия низкоинтенсивным излучением в ближнем инфракрасном диапазоне, разработать протокол использования прототипа с целью восстановления сложноорганизованных комплексов тканей, установить безопасность и эффективность применения разработанного подхода in vivo на модели незаживающих ран у свиней. Будет опубликовано не менее 3 статей в международных журналах, индексируемых в Scopus и/или Web of Science. По результатам выполнения проекта будет разработан новый подход к восстановлению сложноорганизованных комплексов тканей, основанный на применении разработанных прототипа портативного биопринтера «Биоган» и биочернил, и будет опубликовано не менее 10 статей в международных журналах, индексируемых в Scopus и/или WoS.