КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-14-00092

НазваниеКомбинированные противогрибковые препараты для отдельных культур и консорциумов как основа экоориентированных решений

РуководительЕфременко Елена Николаевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2023 г. - 2025 г. 

Конкурс№80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-301 - Охрана окружающей среды

Ключевые словапротивогрибковые препараты, фунгициды, ферменты, компьютерное моделирование, консорциумы, кворум, экологическая безопасность

Код ГРНТИ31.27.22

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Цель Проекта - разработка научно-обоснованных подходов к получению и эффективному применению комплексных противогрибковых препаратов экологической ориентированности с широким спектром противомикробного действия. Предполагается, что за счет реализации в совокупности разных механизмов воздействия на популяции микроскопических грибов и их токсичные метаболиты компоненты разрабатываемых комплексных препаратов будут оказывать разнонаправленное влияние на объекты воздействия. Рациональное комбинирование антимикробных агентов (фунгициды, ферменты, антимикробные пептиды, наночастицы металлов и др.), проявляющих разный механизм воздействия на микроскопические грибы, позволит направленно влиять на рост и развитие как индивидуальных грибных культур (дрожжей и мицелиальных грибов), так и микроскопических грибов, входящих в состав микробных консорциумов, содержащих и другие типы микроорганизмов (другие грибы, бактерии, микроводоросли). В состав антигрибковых комплексов также предполагается включение компонентов, способных подавлять кворумные ответы и осуществлять детоксификацию микотоксинов (низкомолекулярных вторичных метаболитов клеток в высококонцентрированных популяциях микроскопических грибов) и/или ингибировать механизмы их биосинтеза. Теоретические и научно-обоснованные подходы к созданию противогрибковых комплексных препаратов, подтвержденные биоинформационными путями, в том числе с применением методов компьютерного молекулярного моделирования, предполагают проверку на лабораторных биобъектах с оценкой экотоксичности полученных вариантов сред до и после применения полученных разработок. Основными научными задачами этого Проекта являются: - научное обоснование выбора состава противогрибковых препаратов комплексного действия на одиночные культуры микроскопических грибов и грибы, находящиеся в состоянии множественного кворума в консорциумах; - получение образцов противогрибковых препаратов комплексного действия и их характеризация; - конструирование искусственных консорциумов, в том числе в иммобилизованном виде, различного микробного состава для анализа противогрибковых препаратов комплексного действия; - исследование биологической активности (по всем основным показателям в зависимости от механизма воздействия компонентов комплексных препаратов) и эффективности действия (определение условий воздействия и доз) полученных образцов противогрибковых препаратов комплексного действия на индивидуальных смешанных культурах (природных и модельных консорциумах); - обобщение полученных данных с целью выявления общих закономерностей в функционировании комбинированных форм противогрибковых препаратов и объектов воздействия. Также ожидается, что разработка и применение комбинированных противогрибковых препаратов будут способствовать: - формированию научных стратегий рационального комбинирования отобранных партнеров для введения в состав эффективно функционирующих противогрибковых препаратов; - повышению эффективности действия применяемых на сегодняшний день препаратов против микроскопических грибов, в том числе входящих в гетерогенные по составу микробные консорциумы; - расширению диапазона чувствительных к действию противогрибковых препаратов культур благодаря комбинированию в составе комплексов антимикробных агентов с разной специфичностью и механизмами действия; - детоксификации сред с микотоксинами и предотвращению развития антибиотикорезистентности за счёт подавления способности микроскопических грибов формировать устойчивые популяции. В условиях накапливающейся информации о нарастающей резистентности микроскопических грибов к существующим противогрибковым препаратам, наличие информации по воздействию отдельных фунгицидов только на индивидуальные культуры, заявленные в Проекте задачи и ожидаемые результаты, будут обладать новизной, научной и практической значимостью, превосходить современный уровень науки, развивающейся в данном направлении.

Ожидаемые результаты
В качестве основных результатов данного Проекта ожидается разработка ряда оригинальных эффективных комбинированных препаратов с противогрибковой активностью, состоящих из нескольких основных компонентов, характеризующихся разными механизмами воздействия на микроскопические грибы (мицелиальные грибы и дрожжи): подавляющие рост и размножение и/или приводящие к гибели клеток, супрессирующие их метаболизм, разрушающие кворумный ответ клеток, прерывающие синтез микотоксинов и деградирующие уже синтезированные молекулы микотоксинов. Рациональный скриниг и научно-обоснованный выбор наилучшим образом сочетающихся между собой химических агентов-компонентов создаваемых комбинированных препаратов будет осуществлен с применением биоинформационных баз данных и методов компьютерного молекулярного моделирования. Последующее экспериментальное исследование свойств сконструированных комбинированных противогрибковых препаратов должно подтвердить эффективность их применения не только по отношению к ряду индивидуальных культур микроскопических грибов, но и быть эффективными в своем действии по отношению к микроскопическим грибам в составе гетерогенных консорциумов. Для проведения исследований полученных вариантов комбинаций противогрибковых агентов будут использованы природные и искусственные микробные консорциумы разного состава в свободной и иммобилизованной форме, моделирующие природные образцы. Помимо анализа современными методами (in silico и in vitro) основных характеристик конструируемых комплексных противогрибковых агентов (функциональность, физико-химические свойства, стабильность, эффективность антимикробной активности, др.), будет получена оценка их экотоксичности, а также сред, получаемых после их применения. В качестве основных результатов также ожидается, что разработка и применение комбинированных противогрибковых препаратов будет способствовать: - формированию научных стратегий рационального комбинирования отобранных партнеров для введения в состав эффективно функционирующих противогрибковых препаратов; - повышению эффективности действия применяемых на сегодняшний день препаратов против микроскопических грибов, в том числе входящих в гетерогенные по составу микробные консорциумы, - расширению диапазона чувствительных к действию противогрибковых препаратов культур благодаря комбинированию в составе комплексов антимикробных агентов с разной специфичностью и механизмами действия; - детоксификации сред с микотоксинами и предотвращению развития антибиотикорезистентности за счёт подавления способности микроскопических грибов формировать устойчивые популяции. Поскольку создание новых антибиотиков является длительным и затратным процессом, то при нарастающей интенсивности проблемы, связанной с необходимостью использования эффективных противогрибковых препаратов, можно ожидать, что большинство современных исследований будет в ближайшее время направлено именно на комбинирование уже применяемых на практике антимикробных агентов с разными свойствами вами для повышения эффективности их антимикробного действия в отношении клеток патогенов, и в первую очередь, в медицине. Данный Проект может стать одним из таких исследований, который будет характеризоваться оригинальностью предлагаемых к реализации подходов, опираться на знания в области органической химии, химической энзимологии, биохимии, микробиологии, биотехнологии экологии, и ориентироваться не только на опыт исследователей, входящих в состав исполнителей Проекта. В целом противогрибковые комплексные препараты, предлагаемые к разработке в Проекте, предназначены для возможного практического применения без ущерба экологии для решения широкого спектра задач, связанных с контаминацией микроскопическими грибами, в сельском хозяйстве, в пищевой промышленности, в составе тканевых (защитных, фильтрующе-сорбирующих и др.) материалов, в процессах очистки стоков производственных и промышленных отходов, в строительстве, а также в лесном хозяйстве. В перспективе в результате реализации проекта будут получены новые знания и подходы к регулированию численности грибковых популяций, которые при их дальнейшем развитии смогут найти применение, в том числе в ветеринарной практике и медицине.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проект направлен на разработку научно-обоснованных подходов к получению и эффективному применению комплексных антифунгальных (АФ) препаратов с широким спектром действия, разными механизмами и мишенями воздействия. Оригинальность научных решений проекта состоит в применении ферментовв комбинации с разными АФ-агентами. Отбор агентов для комбинирования с ферментами был проведен среди веществ из разных групп на основе анализа научных разработок преимущественно за последние 5 лет и текущей информации о АФ-веществах из открытых баз данных. В результате для комбинирования с ферментами были отобраны: 49 антимикробных пептидов (АМП); 37 фунгицидов; 18 соединений с антиоксидантной и противогрибковой активностью, 4 химически модифицированных производных гуминовых кислот; 8 металлов, а также 7 оксидов, 4 образца наноматериалов, которые не содержат металл в своем составе, 4 МОК, а также 7 ароматических спиртов. Ферменты для комбинаций с АФ-агентами выбирались из числа тех, что имели: гидролитическую или окислительно-восстановительную активность по отношению к сигнальным молекулам кворума грибов (16 ферментов); гидролитическую активностью в отношении компонентов клеток грибов (17 ферментов); гидролитическую или окислительно-восстановительную активность по отношению к микотоксинам (32 фермента). После этого для всех этих 65 ферментов проводилось компьютерное моделирование и изучение методом молекулярного докинга, во-первых, возможных взаимодействий отобранных ферментов с их потенциальными субстратами (это одна из сторон новизны результатов проекта), во-вторых, проводилась симуляционная оценка in silico возможных взаимодействий молекул ферментов и АФ-агентов, вводимых в комбинации, для выявления возможного экранирования активных центров ферментов и ингибирования катализа. Всего в проекте было проанализировано 784 пары «фермент/субстрат» и 2350 пар «фермент/АФ-агент» с получением для каждой пары по 12 компьютерных молекулярных моделей. В результате оценки in silico ферментов как катализаторов деструкции молекул кворума грибов для экспериментов in vitro из 17 осталось 10 ферментов и трилактон-содержащих субстрата. Определение каталитических характеристик in vitro позволило впервые подтвердить эффективный гидролиз сигнальной молекулы кворума грибов - γ-гепталактона–рядом ферментов, которые по убыванию эффективности катализа расположили в ряд: NDM-1 >AiiA>His6-OPH. Дляметалло-β-лактамазыNDM-1 это был впервые показанный гидролиз молекулы кворума грибов, который был значительно эффективнее, чем с лактоназой AiiA и органофосфатгидролазой His6-OPH (в 7,5 и 57,5 раз), имеющими высокие лактоназные активности по кворумным молекулам бактерий, и более эффективнее (в 1,8 и 2,8 раз) чем с лактоназами AaL и ZEN в той же реакции. Впервые было установлено, что комбинирование ферментов между собой позволяет заметно увеличить степень гидролиза γ-гепталактона (комбинация двух ферментов NDM-1/AiiA давала улучшение в 2,5 раз). Впервые была установлена АФ-активность ко всем протестированным культурам грибов и дрожжей у химически модифицированных гуминовых кислот (ГК) и впервые показано, что комбинации ГК, модифицированных нафтохиноном, c фунгицидом пенканазолом или с МОК, HKUST-1, содержащим медь, эффективны против мицелиальных грибов и дрожжей. При этом дрожжи наиболее чувствительны к таким комбинациям, которые давали эффект, превосходящий в 100 раз действие природных ГК с ионами меди. Был проведен компьютерный анализ моделей взаимодействий 16 ферментов, разрушающих сигнальные молекулы кворума грибов, с 32 АМП, 31 молекулой фунгицидов, 18 антиоксидантами, 7 молекулами ароматических спиртов и с 18 вариантами различных наночастиц (НЧ). Показано, что только 3 фермента (AiiA, NDM-1 и His6-OPH) могут в комбинациях со всеми вариантами АФ-агентов сохранить доступность своих активных центров для гидролиза субстратов. Наличие АФ-активности у всех полученных комбинаций было исследовано in vitro с использованием грибов Rhizopus oryzae, Aspergillus niger, Trichoderma atroviride, Fusarium solani, и дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida tropicalis. Скрининг проводился с применением биолюминесцентной АТФ-метрии. Контролировалось проявление АФ-эффекта индивидуальными компонентами комбинаций, включая сами ферменты. Показано, что все исследованные АМП имеют крайне низкую эффективность АФ-воздействия на грибы. Среди фунгицидов слабые АФ-свойства проявлял лишь цинеб. Среди МОК значительный АФ-эффект имело соединение с Ce, которое вызывало снижение АТФ в клетках на 70-99%, Cu-содержащий HKUST-1 снижал концентрацию АТФ в клетках на 90-97%. Лактоназа AiiA проявила АФ-эффективность против грибов T.atroviride, F.solani, R. oryzae, которое было сопоставимо с действием фунгицидов. Это было установлено впервые и может иметь практическую значимость. Комбинирование AiiA как с фунгицидами, так и с МОК давало еще более сильный АФ-эффект. Способность лактамазы NDM-1 проявлять АФ-активность к мицелиальным грибам была выявлена впервые. При этом на клетках дрожжей АФ-эффект отсутствовал. Фермент His6-OPH со слабым собственным АФ-эффектом оказался очень успешным в комбинациях (например, в NDM-1/His6-OPH/полимиксин В), которые были успешны именно против дрожжей. Среди максимально эффективных вариантов были отмечены AiiA/полимиксин В, AiiA/клотримазол, AiiA/Ce-MOF, NDM-1/полимиксин В, NDM-1/клотримазол, NDM-1/Ce-MOК, His6-OPH/полимиксин В, His6-OPH/клотримазол, His6-OPH/цинеб, His6-OPH/Ce-MOК и His6-OPH/HKUST-1. 17 ферментов, деградирующих компоненты грибов, анализировались методом молекулярного докингана возможность каталитического взаимодействия с 10 молекулами компонентов клеточной стенки грибов, и только 11 ферментов подходили далее для определения их каталитических и физико-химические характеристик. Хитиназы были более эффективны в качестве АФ-агентов, чем глюканазы (в 1,2-3,7 раза), и катализировали гидролиз большего числа субстратов в эксперименте. Последующее компьютерное молекулярное моделирование взаимодействия ферментов, деградирующих компоненты грибов, с 30 АМП, 37 фунгицидами, 18 антиоксидантами, 7 молекулами ароматических спиртов и 18 металлосодержащими НЧ показало, что в исследованиях in vitro целесообразно применить только 6 ферментов в их комбинациях с АФ-агентами. Эти эксперименты впервые выявили лучшие варианты: с фунгицидом (хитиназа/клотримазол, β-глюканаза/клотримазол), с МОК (хитиназа/HKUST-1, β-глюканаза /HKUST-1) и с АМП (хитиназа/полимиксин В, хитиназа/колистин). Впервые был проведен объемный скрининг ферментов с гидролитической или окислительно-восстановительной активностью по отношению к микотоксинам грибов, проявляющейся при рН ниже нейтральных. 32 фермента были отобраны и исследованы in silico в этой части проекта с молекулярным докингом 18 микотоксинов в качестве субстратов. После этого в исследовании осталось только 6 ферментов, так как у остальных были выявлены сложности для катализа. Компьютерное моделирование взаимодействий 6 отобранных ферментов, деградирующих микотоксины, с 37 фунгицидами, 25 антиоксидантами и ингибиторами кворума, 24 образцами наноматериалов, 47 АПМ дало наилучшие варианты для исследования in vitro с клетками грибов и дрожжей. Были получены следующие результаты (эффект зависел от микроорганизма): комбинация глюкозооксидазы с колистином улучшила его эффективность действия в 1,7–29,5 раз, с клотримазолом - в 2,2–73,1 раз в отношении 5 мицелиальных грибов и дрожжей, с цинебом - в 10,4–196, с HKUST-1 - в 1,7–42,7 раз в отношении 4 мицелиальных грибов и дрожжей, с MIL-53 - в 2,4–16,1 раз в отношении 4 культур грибов и дрожжей, с НЧAg - в 2–3,4 раза в отношении 2 штаммов грибов и дрожжей, при этом против спор произошло улучшение АФ-эффекта в 1,5–15,6 раз для всех споровых культур, с пенконазолом улучшение его эффективности действия было в 2,5–60,8 раз. Полученные показатели достигнуты впервые, как и впервые получены столь эффективные комбинированные варианты АФ-фермент-содержащих агентов, в том числе способных деградировать микотоксины.

 

Публикации

1. Домнин М.В., Асланлы А.Г., Ефременко Е.Н. Исследование взаимодействий антимикробных пептидов низина и даптомицина с His6-OPH Материалы XVI-й Международной студенческой научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии», - (год публикации - 2023)

2. Ефременко Е.Н., Асланлы А.Г., Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В. Various Biomimetics, Including Peptides as Antifungals Biomimetics, Том-8, Выпуск-7, Номер статьи-513 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/biomimetics8070513

3. Ефременко Е.Н., Сенько О.В., Степанов Н.А., Асланлы А.Г., Маслова О.В., Лягин И.В. Quorum Sensing as a Trigger That Improves Characteristics of Microbial Biocatalysts Microorganisms, Том-11, Выпуск-6, Номер статьи-1395 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/microorganisms11061395

4. Лягин И.В., Асланлы А.Г., Домнин М.В., Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В., Ефременко Е.Н., Metal Nanomaterials and Hydrolytic Enzyme-Based Formulations for Improved Antifungal Activity International Journal of Molecular Sciences, Том-24, Выпуск-14, Номер статьи-11359 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms241411359

5. Ефременко Е.Н., Маслова О.В., Лягин И.В., Асланлы А.Г., Сенько О.В., Степанов Н.А., Домнин М.В., Гайдамака С.Н., Агаева М.У., Гайдамака А.О. Перспективы включения металлсодержащих соединений и ферментов в состав противогрибковых препаратов Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 25 сентября 2023г, ООО “Экспо-Биохим-Технологии” Москва, выпуск 21, с.110-111 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.37747/2312-640X-2023-21-110-111

6. Маслова О.В., Асланлы А.Г., Сенько О.В., Ефременко Е.Н. Исследование воздействия комбинации бацитрацина и пенициллинацилазы в отношении грибов рода Aspergillus Материалы 13-ой Международной научной конференции «Биокатализ. Фундаментальные исследования и применения» (БИОКАТАЛИЗ - 2023), Суздаль, 25-29 июня 2023, ООО «АДМИРАЛ ПРИНТ», Москва, с.245 (год публикации - 2023)

7. Степанов Н.А., Сенько О.В., Маслова О.В., Асланлы А.Г., Гайдамака С.Н., Агаева М.У., Гайдамака А.О., Лягин И.В., Ефременко Е.Н. Противогрибковые свойства гуминовых веществ Разработка лекарственных средств – традиции и перспектиивы. II Международная научно-практическая конференция (г. Томск, 04-06 октября 2023 г.): сборник материалов; под ред. М.В. Белоусова, СибГМУ, Томск, с.271-273 (год публикации - 2023)

8. - ГСУ Блокировка грибов Радиостанция "Радио Звезда", 29.11.2023г в 8:40 и 10:39 (год публикации - )