КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-14-00316

НазваниеОсобенности иммунной системы и кишечной микробиоты синантропных рукокрылых как основа прогнозирования новых инфекций

РуководительЕрмаков Алексей Михайлович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Донской государственный технический университет", Ростовская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2023 г. - 2025 г.

Конкурс№80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые словалетучие мыши, иммунобиология, секвенирование, антибиотикорезистентность, ветеринария, эпизоотология, инфекции, эмерджентные болезни, 3D-биопечать

Код ГРНТИ34.27.29

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Всемирная организация по охране здоровья животных (Международное эпизоотическое бюро) считает, что дикие животные являются самым важным и при этом самым неизученным звеном в возникновении новых (эмерджентных) инфекций, являясь одной из самых главных проблем современной ветеринарии (https://rr-asia.oie.int/en/projects/wildlife-health/). Летучие мыши, первичный резервуар множества возникающих инфекций человека и продуктивных животных, являются причиной многомиллиардных убытков (32,6 миллиарда долларов в 2015г. по данным Всемирного банка) для сельского хозяйства и здравоохранения. Благодаря способности к полёту и длительному сроку жизни (относительно других млекопитающих того же размера) летучие мыши способны распространять вирусы и бактерии на большие расстояния в длительном временном измерении. Механизмы, которые делают этих животных "живыми биореакторами" новых инфекционных агентов, до конца не изучены. Во время полёта в организме летучих мышей образуется много свободных радикалов, которые нарушают работу вирусных полимераз, что в свою очередь способствует возникновению мутаций у вирусов летучих мышей. Помимо особенностей энергетического обмена в возникновении новых вирусов у летучих мышей задействован их уникальный иммунный ответ, обуславливающий сниженную воспалительную реакцию и длительное бессимптомное вирусоносительство. Ранее нами были определены промутагенные свойства кишечных кисломолочных бактерий летучих мышей, что указывает на потенциальную вовлечённость микробиоты этих животных в возникновении мутаций их вирусов и появлении вариантов, способных преодолеть межвидовой барьер (Popov et al., SciRep, 2021). Планируемое исследование направлено на поиск особенностей иммунной системы и кишечной микробиоты синантропных летучих мышей, которые составляют основу возникновния новых инфекций. В проект будет включено цитометрическое иммунофенотипирование популяций и субпопуляций клеток иммунной системы при помощи кросс-реактивных антител и валидация полученных данных относительно транскрипционной экспрессии клеточных маркеров; определение уровня продукции антител при помощи иммунофлюоресцентного анализа; аннотация генов-регуляторов иммунной системы у синантропных рукокрылых; определение уровня экспрессии этих генов; метагеномный анализ состава кишечной бактериальной и вирусной микробиоты; филогенетический анализ обнаруженных микроорганизмов; определение генотоксичности и свойств биоплёнок кишечных бактерий. Все эти свойства будут изучены в динамике жизненного цикла рукокрылых, включающего гибернацию, поскольку влияние понижения температуры тела этих животных безусловно должно оказывать воздействие на свойства их иммунной системы и кишечной микробиоты. В настоящий момент отсутствуют конкретные данные о взаимосвязи динамических изменений статуса иммунной системы и кишечной микробиоты до, во время и после гибернации летучих мышей, поэтому заявляемый проект представляет большую научную значимость для глобальной науки. По результатам проекта будут получены данные о взаимосвязи статуса иммунной системы синантропных рукокрылых и состава и свойств кишечной микробиоты, что обеспечит биологическую безопасность единого здоровья животных и человека, поскольку позволит разработать меры профилактики и контроля возникающих инфекций и снизить прямой и косвенный экономический ущерб от них.

Ожидаемые результаты
Главные ожидаемые результаты проекта: По результатам проекта будут выяснены механизмы влияния иммунной системы летучих мышей в разные этапы их жизненного цикла (до, во время и после гибернации) на состав и свойства кишечной микробиоты, благодаря чему будут выяснены потенциальные предикторы развития новых инфекций. Предполагается, что на фоне снижения функционирования иммунной системы во время гибернации летучих мышей мы сможем увидеть конкретные пути изменения состава и свойств микробиоты, которые являются причиной развития новых инфекционных агентов. Соответствие предполагаемых результатов мировому уровню и их общественная значимость. По результатам проекта будут получены фундаментальные данные i) о геномике рыжих вечерниц и особенностей экспрессии генов-регуляторов иммунной системы до, во время и после гибернации, ii) об иммунофенотипировании популяций и субпопуляций клеток иммунной системы в переферической крови и органах иммунной системы и изменение состава иммунных клеток и уровня антител до, во время и после гибернации, iii) о метагеномике кишечной микробиоты рыжих вечерниц, в том числе филогенетике кишечных вирусов, бактерий и грибов и составе кишечной микробиоты до, во время и после гибернации, iv) о свойствах кишечной микробиоты рыжых вечерниц и их изменений до, во время и после гибернации этих животных. Геномика рыжей вечерницы и метагеномика кишечной микробиоты этого вида животных будут изучены при помощи высокопроизводительного секвенирования нуклеиновых кислот, выделенных из образцов тканей, фекалий и мазков животных. Благодаря этой стандартизированной методике по результатам проекта появится возможность сравнения геномных и метагеномных данных рыжей вечерницы с аналогичными данными других видов рукокрылых из других регионов мира путём сравнительного биоинформатического анализа баз данных. Статистический анализ данных будет проводиться при помощи языка статистического программирования R с применением критериев, соответствующих их мощности размеру выборки и допущениям описательно-статистических показателей полученных количественных результатов, что также соответствует международным стандартам проведения исследований. По данным центра реабилитации рукокрылых города Ростова-на-Дону при ветеринарной клинике ДГТУ рыжая вечерница является наиболее распространённым видом летучих мышей на Европейской части юга России, при этом видовое разнообразие летучих мышей на этой территории является очень обширным - в центре реабилитации за последние два года работы описано более 10 видов. По этой причине рыжая вечерница выбрана в качестве модельного животного для заявляемого проекта. Полученные иммунологические и микробиологические данные от этого вида затем могут быть транслированы на другие виды рукокрылых типичных для Российской Федерации. Полученные результаты будут соответствовать целям Всемирной организации по охране здоровья животных (МЭБ) в рамках программы "Worldwide Monitoring System for Wild Animal Diseases" и представят ценные геномные и эпизоотологические данные для южных регионов Российской Федерации. Возможность практического применения результатов. По результатам проекта будут получены полногеномные данные рыжей вечерницы, данные об экспрессии генов-регуляторов иммунной системы и иммунофенотипирования клеток иммунной системы, данные об изменении уровня антител в динамике жизненного цикла, данные о генах вирулентности, антибиотикорезистентности, филогенетике и превалентности вирусов, бактерий и дрожжеподобных грибов в составе кишечной микробиоты синантропных рукокрылых. Эти данные сами по себе будут представлять ценность для создания и корректировки существующих методов профилактики и эпизоотологического контроля инфекций животных и человека. Эти данные также будут использованы для создания прогностической модели влияния взаимоотношений иммунной системы и микробиоты рукокрылых на возникновение новых инфекций. Также полученные базы данных будут применены для расчёта статистически обоснованных и значимых предикторов возникающих инфекций из числа свойств иммунной системы и микробиоты летучих мышей, что в совокупности с остальными результатами многократно обеспечивает практическую пользу проекта. В дополнение ко всему полученные массивы данных станут основой для интеллектуального анализа поисковыми алгоритмами и создания автоматических систем предупреждения возникновения новых болезней общих для животных и человека.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках реализации первого этапа проекта «Особенности иммунной системы и кишечной микробиоты синантропных рукокрылых как основа прогнозирования новых инфекций» был начат сбор биологического материала (образцы фекалий, тканей и периферической крови) летучих мышей вида рыжая вечерница (Nyctalus noctula) на базе центра реабилитации летучих мышей ДГТУ и создана коллекция геномной ДНК, метагеномной ДНК и метавиромной РНК, которая будет использоваться на протяжении всего периода реализации проекта. Для проведения анализа популяций мононуклеарных клеток периферической крови рыжих вечерниц было апробировано 33 антитела, чувствительных к молекулярным мишеням мыши (Mus musculus), 3 из которых продемонстрировали наибольшую среди прочих аффинность к клеткам рыжих вечерниц: CD8a, IgM и Ly6C. Данные результаты дают возможность оценки изменений количества популяций CD8a+ (Т-киллеры), IgM+ (B-лимфоциты) и Ly6C+ (моноциты) клеток в динамике жизненного цикла рыжих вечерниц или при их иммунизации. Так, например, в рамках первого этапа проекта была проведена оценка количества популяций этих клеток у гибернирующих и активных (после гибернации) рыжих вечерниц, по результатам чего было выявлено статистически значимое повышение количества потенциальных Т-киллеров и B-лимфоцитов, что возможно демонстрирует повышенную активность адаптивного иммунитета после выхода рукокрылых из гибернации. Однако на данный момент мы не можем дефинитивно утверждать об изменении активности адаптивной иммунитета во время гибернации рыжих вечерниц и во время их активного состояния без геномных и транскриптомных данных, которые необходимы для подтверждения результатов обнаруженной потенциальной кросс-специфичности антител посредством определения гомологии кодирующих нуклеотидных и аминокислотных последовательностей молекулярных мишеней, к которым специфичны антитела. Геном и транскриптом рыжей вечерницы будут собраны и проаннотированы в ходе следующих этапов реализации проекта, что позволит окончательно валидировать полученные результаты в рамках первого этапа. Также в рамках реализации первого этапа проекта впервые был изучен состав кишечной микробиоты рыжих вечерниц на основании бактериологического и метагеномного анализа. Было выявлено, что синантропные рыжие вечерницы являются резервуарами потенциально патогенных бактерий для человека и животных, принадлежащих родам Bacteroides, Enterobacter, Clostridiaceae, Enterococcus, Ureaplasma, Faecalibacterium, Citrobacter, Klebsiella, Providencia и Helicobacter, а также молочнокислых бактерий из родов Pediococcus, Lactobacillus, Lactococcus и Weisella. Также были выяснены конкретные изменения в составе кишечной микробиоте рыжих вечерниц, самым выраженным из которых является снижение альфа и бета разнообразия кишечных бактерий, а также снижение количества оппортунистических патогенов (Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, Providencia rettgeri и Citrobacter braakii) у гибернирующих рыжих вечерниц в сравнении с летучими мышами того же вида в активном состоянии. Помимо этого, были определены гены устойчивости к антибиотикам (EhpR, MarA, MarR, ArpB и ArpC) в кишечной микробиоте рыжих вечерниц, что подтверждает нашу гипотезу о вовлечении этих животных в распространение генов антибиотикорезистентности в окружающей среде и подчёркивает важность изучения синантропных рукокрылых. Результаты первого этапа реализации проекта опубликованы в двух журналах Q1: Animals (Impact Factor 3.0) и International Journal of Molecular Sciences (Impact Factor 5.6), а также представлены на международных конференциях по ветеринарной медицине, микробиоте животных и молекулярной иммунобиологии. Таким образом, заявленные в рамках первого этапа проекта исследования выполнены в полном объеме и широко представлены на международном уровне.

Публикации

1. Попов И.В., Березинская И.С., Попов И.В., Мартюшева И.Б., Ткачева Е.В., Горобец В.Е., Тихменева Ю.А., Алешукина А.В., Твердохлебова Т.И., Чикиндас М.Л., Венема К., Ермаков А.М. Cultivable Gut Microbiota in Synanthropic Bats: Shifts of Its Composition and Diversity Associated with Hibernation Animals, - №. 23. -Т. 13. -С. 3658. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ani13233658

2. Попов И.В., Попов И.В., Крикунова А.А., Липилкина Т.А., Дерезина Т.Н., Чикиндас М.Л., Венема К., Ермаков А.М. Gut microbiota composition of insectivorous synanthropic and fructivorous zoo bats: a direct metagenomic comparison International Journal of Molecular Sciences, - №. 23. -Т. 24. -С. 17301. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms242417301

3. - Ученые ДГТУ не обнаружили особо опасных бактерий у летучих мышей в спячке BezFormata.Com, - (год публикации - )

4. - Российские ученые исследовали кишечные микробиомы летучих мышей PCR.news, - (год публикации - )