КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-14-00390

НазваниеРазработка таргетной системы доставки противоопухолевых агентов и инструментария для ретаргетирования вирусных векторов

РуководительЧумаков Степан Петрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2023 г. - 2025 г. 

Конкурс№80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаVHH, ретаргетирование, нанотела, мезотелиома, РМЖ, лентивирусные векторы, MSLN, ERBB2, вирусные онколитики, онколитический вирус кори, вирус Нипах

Код ГРНТИ34.15.17

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Ключевым условием практического применения генетически-кодируемых противоопухолевых агентов, также как и в случае терапии генетических нарушений, является разработка адресных средств их доставки и экспрессии. Независимо от того, насколько эффективно транскрипционная регуляция терапевтического агента ограничена условиями, характерными для определенного типа опухолевых клеток, низкая специфичность доставки будет приводить к катастрофическому снижению общей эффективности терапевтического действия. В настоящее время определено несколько подходов к таргетированию вирусных векторов и рекомбинантных онколитиков на определенный клеточный рецептор. Для оболочечных вирусов, в частности, лентивирусов, наиболее универсальным методом является псевдотипирование модифицированными гликопротеинами парамиксовирусов– вируса кори, чумки собак, вируса Нипах, вируса нипайя. Введением точечных мутаций в них подавляется способность связываться с естественными рецепторами, а за счет присоединения нацеливающего домена белкам придается специфичность к целевому рецептору. Такие ретаргетированные гликопротеины могут также быть использованы для создания ретаргетированных штаммов парамиксовирусных онколитиков. В качестве средств нацеливания в составе этих белков уже были использованы одноцепочечные конструкции на основе моноклональных антител (scFv), дарпины и нанотела. Используемые сейчас стратегии предполагают проведение непрямой селекции антител или дарпинов для вирусного ретаргетирования. Сначала производится отбор вариантов, селективно связывающихся с белком-мишенью, а затем кандидатные последовательности испытываются в составе вирусного гликопротеина. Такой двухступенчатый подход имеет низкую эффективность, поскольку отобранный вариант должен обладать рядом дополнительных характеристик, помимо высокого сродства к рецептору мишени – для проникновения важно место связывания и итоговое пространственное расположение вируса и клетки. В рамках предлагаемого проекта планируется создание системы лентивирусного дисплея для прямой селекции вариантов ретаргетирующих нанотел, которая позволит быстро и эффективно отбирать последовательности, пригодные для получения нацеленных вирусных векторов и онколитиков. В рамках проекта будут получены ретаргетирующие нанотела к опухолевому рецептору мезотелину – одной из наиболее перспективных мишеней для направленной терапии ряда злокачественных новообразований с высокой устойчивостью к существующим методам лечения. Этот белок характеризуется ограниченной экспрессией на поверхности нормальных клеток, при этом его гиперэкспрессия характерна для наиболее злокачественных форм нескольких видов рака (рак яичника, легкого, предстательной железы, мезотелиома, трижды-негативный рак молочной железы и др.), он является маркером метастазирования и широко представлен на клетках метастатических очагов. Такие характеристики делают этот белок удобной целью для таргетирования вирусных векторов и онколитиков, что позволит создать высокоэффективные средства терапии продвинутых стадий онкопатологии. Помимо конкретного практического применения, разработанный подход позволит существенно упросить получение новых высокоселективных псевдотипов для создания новых генотерапевтических средств против широкого перечня заболеваний и патологических состояний.

Ожидаемые результаты
В ходе реализации проекта будет разработан и испытан новый метод селекции нанотел для ретаргетирования лентивирусных векторов и парамиксовирусных онколитиков на опухолевые рецепторы или рецепторы, представленные на целевой клеточной популяции. За счет этого появится возможность быстро скринировать библиотеки нанотел для поиска подходящих для ретаргетирования вариантов и получать ретаргетированные векторы для проведения адресной доставки терапевтических агентов в отдельные ткани либо опухоли, что повысит эффективность применения новых разрабатываемых генетически-кодируемых противоопухолевых агентов и откроет дорогу к клиническому внедрению тех подходов, которые до сих пор оставались ограниченными исключительно модельным применением на клеточных культурах и лабораторных животных. За счет снижения офф-таргет эффектов от применения лентивекторных систем доставки станет возможным достичь меньшей выраженности побочных эффектов терапии, а также снизить эффективную дозировку препарата. Разработанный подход позволит избавиться от неэффективной стадии индивидуального тестирования ретаргетирующих белковых молекул, изначально разработанных для иных вариантов применения – моноклональных блокирующих антител, DARPинов и нанотел. Идентифицированные в ходе выполнения проекта новые ретаргетирующие нанотела будут востребованными инструментами для получения высокоэффективных средств направленной доставки противоопухолевых препаратов и средств опухолевой визуализации, а также вирусных онколитиков.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В течение отчетного периода были проведены работы по созданию и оптимизации лентивирусных векторов для селекции вариантов нанотел, способных эффективно ретаргетировать гликопротеин Н вируса кори. Основной акцент был сделан на модификации областей U3 LTR, что позволило повысить эффективность повторной упаковки лентивекторного генома после его первичной трансдукции в клетки. Работы привели к созданию варианта генома лентивектора, клонирование в который гликопротеина Н вируса кори и последующая оценка первичных и вторичных функциональных титров показала высокую эффективность повторной упаковки. Отмечено, что падение титра при вторичной упаковке составляет лишь 3.6х относительно первичного, что является вполне приемлемым для целей селекции. Кроме того, был получен лентивирусный конструкт для экспрессии рекомбинантного мезотелина и успешно созданы клеточные линии, производные от HEK-293LTV, гиперэкспрессирующие рецепторы ERBB2 и мезотелин. Экспрессия этих трансгенов была подтверждена с использованием методов иммунофлуоресцентного окрашивания и иммуноферментного анализа. Была проведена отработка условий проведения селекции нанотел в лентивирусной системе с использованием специально созданной библиотеки VHH-фрагментов антител, полученных от животного, ранее иммунизированного ERBB2. В качестве мишени использовалась клеточная линия HEK-293ERBB2, что позволило получить важные данные об условиях трансфекции для упаковки лентивирусных частиц с минимальной потерей сложности исходной библиотеки, и условиях проведения селекции. В результате был выбран оптимальный вариант селекции, позволяющий провести её за два раунда. Было установлено, что доля последовательностей, позволяющих лентивирусным векторам трансдуцировать клетки не за счет целевого рецептора, минимальна. Таким образом, селекция может проводиться либо с соотношением клеточных популяций 1:1, либо без использования балластных клеток. В процессе проведения тестовой селекции были выделены 5 кандидатных вариантов нанотел, которые демонстрировали высокую специфичность действия и селективность ретаргетирования лентивирусных частиц на рецептор ERBB2. Четыре из этих вариантов показали отсутствие неспецифичного взаимодействия с другими клеточными рецепторами, а один из вариантов обладал эффективностью действия, сопоставимой с известным дарпином 9.29. Далее, была проведена иммунизация животного рекомбинантным мезотелином и создана библиотека ПЦР-фрагментов последовательностей нанотел иммунизированного животного. Эта библиотека затем была успешно клонирована в лентивирусную систему, и проведена селекция на клеточной линии HEK-293-meso, гиперэкспрессирующей мезотелин. Показанное значительное увеличение вторичного титра между первым и вторым раундами селекции указывает на успешность процесса. В результате было идентифицировано 18 эффективных вариантов последовательностей нанотел, способных ретаргетировать вирусный белок Н на опухолевый рецептор мезотелин.

 

Публикации

1. Екатерина Книжник, Степан Чумаков, Юлия Светлова, Юлия Павлова, Юрий Ходарович, Владимир Брылев, Вячеслав Северов, Ругия Алиева, Любовь Козловская, Дмитрий Андреев, Андрей Аралов, Анна Варижук Unwinding the SARS-CoV-2 ribosomal frameshifting pseudoknot with LNA and G-clamp-modified phosphorothioate oligonucleotides inhibits viral replication Biomolecules, Biomolecules 2023, 13(11), 1660 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/biom13111660

2. Ратникова Н.М., Кравченко Ю.Е., Иванова А.Е., Жучков В.А., Фролова Е.И., Чумаков С.П. A novel anti-CD47 nanobody tetramer for cancer therapy Antibodies, - (год публикации - 2023)