КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 20-14-00229

НазваниеПоиск специфического отклика клеток человека на лекарственное воздействие: новые инструментальные и вычислительные методы химической протеомики

РуководительГоршков Михаил Владимирович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2023 г. - 2024 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (45).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словапротеомика, масс-спектрометрия, биоинформатика, клеточный стресс, рак яичников, химиотерапия, термическая денатурация белков, белковые взаимодействия, белковые комплексы

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Полнопротеомный анализ количественного содержания белков в тканях или физиологических жидкостях, основанный на масс-спектрометрии, является одним из ключевых источников информации о механизмах лекарственного воздействия, влияния внешних факторов, или изменений физиологического состояния (PMID: 27629641), Реализация методов такого анализа в практике биомедицинских исследований позволяет находить новые подходы к мониторингу эффективности терапевтического воздействия и персонализированной разработке лекарственных препаратов для воздействия на определенные группы клеток, например, злокачественных (PMID: 36310597; PMID: 35879922; PMID: 32462937; PMID: 30790462; PMID: 31561483; PMID: 25468140). В этой связи особое положение занимает химическая протеомика, одной из основных задач которой является выявление и подтверждение молекулярных мишеней, а также механизмов действия химиотерапевтических препаратов на уровне индивидуального протеома (PMID: 36334421; PMID: 33357463), с которыми могут быть связаны как побочные эффекты или резистентность (PMID: 23690695), так и сам механизм терапевтического эффекта (PMID: 31511426). Вместе с тем, соответствующие протеомные методы и подходы в этой области, несмотря на интенсивные и многочисленные усилия научного сообщества в последние годы, находятся в настоящее время на начальной стадии своего развития (PMID: 35351998; PMID: 36180990). Ранее, научным коллективом проекта были завершены работы по реализации метода ультрабыстрого полнопротеомного количественного анализа DirectMS1 для решения задач химической протеомики, включая как лекарство-центричный поиск молекулярных мишеней на уровне всего протеома, так и механизм-центричный подход, основанный на выявлении всех возможных внутриклеточных белок-белковых взаимодействий, активируемых конкретным препаратом. В частности, было показано, что метод позволяет идентифицировать до нескольких тысяч белков за несколько минут анализа (PMID: 33720732). Также, в рамках Проекта 2020 была завершена разработка программно-аналитического ресурса AA_stat, позволяющего получать количественный профиль модификаций аминокислотных остатков и их локализацию и, соответственно, выявлять изменение в уровне модифицированных белков как отклик на лекарственное воздействие (PMID: 34389500), осуществлена адаптация метода DirectMS1 для поиска мишеней лекарств на основе температурного протеомного профилирования и экспрессионной протеомики (PMID: 36509723). Предлагаемые в проекте исследования будут базироваться на результатах этих работ. В данном проекте исследования и работы будут сфокусированы на практической реализации ранее развитых методов и подходов по трем основным направлениям: (1) выявление специфических для типа рака мишеней и механизмов действия для большого набора систем "лекарство-протеом" (5 онкопрепаратов, 5 клеточных линий рака различного типа); (2) химическая метапротеомика для модельных смесей микроорганизмов, ассоциированных с метабиомом человека, подверженных химическому воздействию; и (3) поиск мишеней взаимодействия протеомов клеточных линий рака различного типа с экспериментальными онкопрепаратами на основе лонидамин-платинового (PMID: 35759404) и рутений-органического комплексов. В реализации проекта будет участвовать коллектив исполнителей с многолетним опытом работы в области биологической масс-спектрометрии, биоинформатики, протеомики и протеогеномики. За последние пять лет коллективом было опубликовано 50 статей в международных изданиях, а исполнители проекта неоднократно выступали с устными и приглашенными докладами на международных и всероссийских конференциях. В работе над проектом будут принимать участие студенты высших учебных заведений.

Ожидаемые результаты
Исполнители планируют получение следующих результатов, как фундаментальных, так и прикладных, при реализации проекта: - с использованием метода ультракороткого полнопротеомного анализа будут получены экспериментальные данные для большой группы систем "лекарство-протеом" и составлены карты специфичности и чувствительности отклика клеток рака разного типа на воздействие группы используемых в клинической практике онкопрепаратов, включающих препараты ингибирования убиквитин-протеасомной активности, аэробного гликолиза и др. с выявленными противоопухолевыми эффектами. Полученные данные будут использованы для создания новых моделей опухолевого развития и разработки персонализированных терапевтических подходов на основе комбинаций лекарственных препаратов более высокой селективности воздействия по сравнению с существующими. Специфичность отклика будет определяться индивидуальным профилем белков, концентрация которых существенным образом изменилась в результате воздействия; - будут разработаны и протестированы новые методы химической протеомики для анализа взаимодействия химиотерапевтических препаратов с клеточными протеомами, в частности, методы на основе капиллярного электрофореза и/или pH-специфичной преципитации белков; - будут получены экспериментальные данные для наборов "лекарство-протеом" по выявлению долговременного механизма химиотерапевтического действия малых концентраций лекарств на изменения профиля протеома с целью тестирования существующих или обсуждаемые в настоящее время в литературе гипотез о фундаментальных механизмах развития побочных эффектов и резистентности на примере раковых клеток; - будут разработаны протеомные и биоинформатические подходы к анализу изменения концентраций белков клеток рака в ответ на воздействие, которые могут быть использованы для решения широкого круга биомедицинских задач, связанных с выявлением изменений в функциональности белков в развитии патологий; - будет продолжена разработка алгоритмов, программных средств и общедоступных биоинформатических ресурсов на их основе для специализированного «майнинга» протеомных данных с целью поиска продуктов неспецифического гидролиза белков в клетках, ассоциированного с химиотерапевтическим воздействием. Тестирование создаваемых биоинформатических ресурсов будет осуществляться на примере экспериментальных данных для больших наборов "фермент-протеом", полученных методами функциональной идентификации мишеней на основе экспрессии белков FITExP и интегрального изменения растворимости белков PISA в Каролинском институте; - будут получены предварительные данные по химической метапротеомике на основе метода ультракороткого полнопротеомного количественного анализа DirectMS1 на примере лекарственного взаимодействия с модельными смесями микроорганизмов, ассоциированных с метабиомом человека, и продемонстрированы возможности хроматомасс-спектрометрии в выявлении организм-специфичного развития отклика метабиомного сообщества на внешнее химическое воздействие;. - будут получены и проанализированы полнопротеомные данные по взаимодействию новых экспериментальных онкопрепаратов на основе лонидамин-платинового и рутений-органического комплексов, разработанных партнерами из Химического факультета МГУ, с раковыми клетками различного типа, и составлен список возможных белковых мишеней препарата и активируемых им каскадов белок-белковых взаимодействий на уровне всего протеома. Запланированные результаты будут соответствовать мировому уровню исследований в области химической протеомики и методологии хроматомасс-спектрометрических экспериментов и обработки данных. Практическое использование разработанных в рамках проекта методов и программного обеспечения видится в задачах быстрого анализа больших наборов систем "лекарство-протеом", в том числе для исследования социально значимых заболеваний на больших выборках образцов, а также при разработке химиотерапевтических препаратов нового поколения с высокой специфичностью действия. Результаты проекта планируется опубликовать в 8 статьях в импактных изданиях, индексируемых в международных системах научного цитирования Web of Science и Scopus.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Основной задачей проекта являлась развитие методов химической протеомики с целью выявления ответственных за реакцию на лекарственное воздействие белков клеточных линий злокачественных опухолей, в том числе, их протеоформ, включая белки, не являющиеся прямыми терапевтическими мишенями. Еще одной из задач проекта являлся анализ экспериментальных данных, полученных для наборов систем “лекарство-протеом” с использованием нового метода прямой масс-спектрометрической идентификации белков DirectMS1 и ультракоротких градиентов разделения, метода химической протеомики на основе температурного протеомного профилирования, а также стандартных методов экспрессионной протеомики. Работа над проектом в 2023 г. велась по трем основным направлениям: (1) разработка биоинформатических ресурсов и программных средств, а также тестирование созданных ресурсов на экспериментальных данных, полученных при реализации проекта. В рамках этого направления осуществлялись работы по развитию утилит для обработки данных полнопротеомного температурного профилирования TPP на основе ультракороткого анализа, построение кривых растворимости белков и определение их температурных точек плавления, обработку новых данных экспрессионной протеомики для набора лекарств, включающих экспериментальный препарат IZ11, а также разработке алгоритмов поиска полутриптичеких пептидов в данных протеомного анализа, являющихся эндогенными продуктами активности энзимов; (2) наработка экспериментальных данных экспрессионной протеомики на основе ультракороткого метода анализа DirectMS1 для систем «лекарство-протеом» для набора противоопухолевых химиотерапевтических препаратов различного механизма действия, включая противоопухолевый препарат 8-azaguaninе и экспериментальное соединение IZ11 на основе органометаллического комплекса с лонидамином; и (3) проведение фундаментальных исследований, связанных, в частности, с созданием формализма на основе термодинамики фолдинга белков для построения кривых растворимости на основе хроматомасс-спектрометрических данных полуколичественного полнопротеомного профилирования, а также интерактомный анализ механизмов действия для экспериментально проанализированных в проекте систем “лекарство-протеом”. В отчетный период 2023 года были получены следующие основные результаты в рамках этих направлений исследований: - наработаны (на базе ЦКП Каролинского института) и проанализированы экспериментальные данные экспрессионной протеомики для клеточной линии А549 с обработкой группой рапалогов рапамицина, включая everolimus, rapamycin и temsirolimus, а также ингибитора протеоасомы bortezomib, для которых выявлены механизмы действия, включая ранее неизвестные для препарата everolimus ( doi: 10.1101/2023.10.15.562182); - получены новые экспериментальные данные с использованием метода ультракороткой протеомики DirectMS1 для экспериментального препарата IZ11 на основе органометаллического комплекса платины с лонидамином и предварительные результаты анализа внутриклеточных процессов, регулируемым воздействием этим препаратом, демонстрирующие механизм действия, связанный с лонидамином, встроенным в его структуру, в частности, ингибирование процессов гликолиза и биосинтеза АТФ; - завершена обработка экспериментальных данных Каролинского института, полученных для больших выборок клеточных линий, включая промиелоцитарной лейкемии HL60, T-лимфобластной лейкемии MOLT4 и острой моноцитарной лейкемии THP1 и набора цистеиновых протеаз (каспазы 1-11), для которых был осуществлен поиск продуктов специфического гидролиза с использованием разработанных в рамках проекта алгоритмов и программных ресурсов “майнинга” протеомных данных и количественной идентификации полутриптических пептидов; - предложена новая методика определения субстратов действия протеаз в задачах химической протеомики, основанная на идентификации продуктов ассоциированного специфического гидролиза и независимого подтверждения мишеней, полученных методом температурного полнопротеомного профилирования на основе интегральной растворимости белков (PISA), развиваемого в Каролинском институте; - развит формализм и методика на его основе для построения кривых растворимости белков на основе количественных протеомных данных, полученных при реализации метода температурного полнопротеомного профилирования ТРР с использованием ультракороткого анализа DirectMS1; - завершен анализ экспериментальных данных ТРР для клеточной линии рака яичников и ингибитора топоизомеразы topotecan с выявлением прямых мишеней взаимодействия с препаратом (всего 14 белков-мишеней), который показал обогащение процессов, связанных с репликацией ДНК, что подтверждает известны механизм действия данного препарата; При работе над проектом в 2023 году были разработаны и поддерживались следующие программные средства и биоинформатические ресурсы, доступные в сети Интернет для исследователей в области протеомики и биоинформатики, включая: - https://github.com/markmipt/biosaur2 - биоинформатическая утилита открытого кода для поиска пептидных кластеров в масс-спектрах первого уровня с использованием информации по ионной подвижности, получаемой на устройствах по разделению пептидов FAIMS (field asymmetric ion mobility spectrometry); - https://github.com/markmipt/ms1searchpy - поисковая протеомная машина открытого кода для реализации метода прямой масс-спектрометрической идентификации белков DirectMS1; - https://github.com/levitsky/pyteomics - библиотека функций открытого кода для работы с протеомными данными и расчетами физико-химических свойств пептидов и белков. В отчетный период осуществлялась поддержка и обновления библиотеки (релиз 4.6.2. от 07.09.2023, включающий модуль pyteomics.fasta.write для работы с разобранными последовательностями белков непосредственно в базе белковых последовательностей. - https://github.com/kazakova/Metrics - утилита QRePS расчета степени количественного отклика клеток на воздействие и анализа генных онтологий для выявленных дифференциально регулируемых воздействием белков. В отчетный период осуществлялась поддержка утилиты и ее использование для решения задач проекта. Результаты работ были представлены в 3 посланных в печать статьях (в журналы Q1), одна из которых обзор по теме проекта, а также докладывались на международных и российских конференциях, включая 1 пленарный, 1 приглашенный, 2 устных доклада и 6 стендовых докладов.

Публикации