КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 23-15-00151
НазваниеПрименение многофункциональных наночастиц для тераностики инфаркта миокарда: флуоресцентная визуализация и мультитаргетное терапевтическое воздействие
РуководительСонин Дмитрий Леонидович, Кандидат медицинских наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Санкт-Петербург
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2023 г. - 2025 г. |
Конкурс№80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-101 - Экспериментальная медицина
Ключевые словаинфаркт миокарда, no-reflow, кардиопротекция, квинакрин, наночастицы, липосомы, таргетная доставка, ишемия, реперфузия, липопротеины, тераностика
Код ГРНТИ76.29.30
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
В последнее время результаты лечения больных с острым инфарктом миокарда (ОИМ) значительно улучшились, в первую очередь благодаря экстренной реваскуляризации миокарда, однако в случае крупноочагового, в особенности передне-перегородочной области, ОИМ, отдалённые результаты лечения могут быть неблагоприятными в виде поздних осложнений и более высокой летальности. Причинами неблагоприятного исхода могут стать промедление с реваскуляризацией и более выраженное ишемическое и реперфузионное повреждение (ИРП) миокарда и коронарного русла, которое неизбежно возникает после успешного стентирования и тромболитической терапии. В литературе, посвящённой механизмам возникновения ИРП и феномена невосстановленного коронарного кровотока (ФНК), накоплены данные, свидетельствующие о развитии асептического воспаления, ведущего к вторичному повреждению миокарда и микроциркуляторного русла.
По нашим данным, внутривенное введение ингибитора PLA2 квинакрина (мепакрин) сопровождается достоверным инфаркт-лимитирующим эффектом (патент на изобретение №2716596) и уменьшением зоны ФНК по результатам гистохимического и флуоресцентного методов исследования. На модели острого воспаления, индуцированного активными формами кислорода (АФК), при фотодинамическом повреждении, мы подтвердили вклад тучных клеток в механизмы нарушений микроциркуляции, вызываемых АФК. Противовоспалительное действие квинакрина оказалось наиболее эффективным в отношении наблюдаемых нарушений микроциркуляции, чем других препаратов с противовоспалительным и антиоксидантным действием.
На первом году заявляемого проекта на экспериментальных моделях ОИМ планируется разработать способ направленной доставки ингибитора PLA2 квинакрина для повышения эффективности кардиопротекции. В качестве средств доставки будут использованы липосомы, содержащие Apo AI липопротеины, и альбуминовые наночастицы. Ожидается, что задержка наночастиц в инфаркте миокарда будет происходить по механизму парацеллюлярного и трансцеллюлярного транспорта, при этом Apo AI липопротеины обеспечат направленную доставку квинакрина в зону повреждения. Инкапсуляция квинакрина в липосомы необходима для повышения концентрации препарата в повреждённом миокарде, уменьшения побочных эффектов и для увеличения продолжительности действия лекарственного средства за счёт иммобилизации на носителе. Для выполнения этой задачи будут использованы ex vivo и in vivo модели ИРП миокарда. Степень уменьшения ФНК будет оцениваться по результатам гистохимического и флуоресцентного методов исследования. Масс-спектрометрическим и флуоресцентным методами (квинакрин-флуоресценция (тераностика)) будет оцениваться эффективность направленной доставки в инфаркт миокарда. На модели ИРП изолированного сердца крыс (ex vivo) будет проведено сравнительное исследование инфаркт-лимитирующего эффекта действующих веществ: квинакрина, никорандила, мексидола, кетотифена и пептида ПИК7 и их комбинаций.
На втором году работы по проекту будет проводиться сравнение свободных форм препаратов, отобранных на первом году работы по проекту, и связанных с наночастицами (липосомами и альбуминовыми наночастицами). С использованием модели ИРП in vivo будет проведено сравнительное исследование дозозависимого влияния квинакрина и его сочетания с мексидолом на инфаркт-лимитирующий эффект и активацию тучных клеток (запуск воспаления). По окончании сравнительного исследования будут выбраны наиболее эффективное сочетание, уменьшающее размер инфаркта и ФНК.
Также на этом этапе исследования будет изучено влияние квинакрина в свободной и связанной с наночастицами форме на постинфарктное ремоделирование в хронических экспериментах на крысах. Полученные результаты ответят на вопрос о безопасности использования разрабатываемого способа кардиопротекции.
На третьем году в качестве доклинического этапа исследования будет изучен инфаркт-лимитирующий эффект квинакрина в свободной и связанной с наночастицами форме у свиней.
Ожидаемые результаты
По итогам выполнения проекта ожидается получение важнейшего результата в виде экспериментального обоснования нового направления в защите миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения (ИРП) — таргетной доставки кардиопротективных субстанций непосредственно в зону ишемии-реперфузии. Данный конечный результат складывается из ряда промежуточных результатов, полученных в ходе выполнения проекта.
В ходе первого года выполнения проекта на экспериментальных моделях ОИМ планируется разработать способ направленной доставки ингибитора PLA2 квинакрина, а также активатора АТФ-зависимых калиевых каналов и вазодилататора никорандила, антиоксиданта мексидола и ингибитора киназы легких цепей миозина, пептида ПИК7, для повышения эффективности кардиопротекции. Сравнение кардиопротективной эффективности исследуемых препаратов и их сочетаний будет проведено на модели ишемии и реперфузии изолированного сердца, что позволит выбрать наиболее эффективный вариант действующего вещества для последующих исследований на доклиническом этапе.
Инфаркт-лимитирующая эффективность выбранных на первом этапе соединений и степень уменьшения феномена невосстаноленного кровотока (ФНК) будет изучена в острых экспериментах на модели ишемии-реперфузии миокарда у крыс in vivo с физиологическим мониторингом и оценкой размера инфаркта гистохимическим и флуоресцентным методами исследования. Физиологический мониторинг в острых экспериментах позволит оценить влияние иммобилизации действующего вещества (например, квинакрина) на проявление его побочного эффекта на гемодинамику (урежения ритма и снижения артериального давления).
В качестве средств доставки будут использованы липосомы и альбуминовые наночастицы (АНЧ), эффективность которых будет сравниваться. Будет отработан синтез больших многослойных липосом методом гидратации тонких пленок и малых однослойных липосом методом сонификации и экструзионным методом. Известно, что липосомы, содержащие Apo AI липопротеины, более эффективно задерживаются в повреждённой ткани. В связи с этим, будут разработаны методики поверхностной иммобилизации Apo AI липопротеина на поверхности липосом, инкапсуляции исследуемых веществ (квинакрина и никорандила) в липосомы и иммобилизации их на альбуминовых наночастицах.
Будет разработана методика синтеза наночастиц альбумина путем поликонденсации и различными сшивающими агентами подобраны оптимальные параметры синтеза для получения заданных размеров наночастиц. Будут отработаны методы их функционализации и поверхностной иммобилизации исследуемых лекарственных средств на поверхности АНЧ с проведением сравнительной оценки различных способов иммобилизации (адсорбционная, ионная, ковалентная). На основе кривых кинетики связывания-высвобождения действующих веществ будут выбраны оптимальные для конкретных носителей и действующих веществ варианты иммобилизации для последующих исследований. Будут получены данные о биологической совместимости и острой токсичности изучаемых наноматериалов в экспериментах на животных. Результаты разработок АНЧ будут иметь научную новизну, так как в доступной нам литературе нет информации о разработках наночастиц на основе альбумина для доставки в инфаркт миокарда.
Будут получены доказательства пассивной доставки в зону повреждения, то есть накопления наночастиц в инфаркте миокарда, путём иммобилизации флуорофора на наноносителе. Кроме того, исследуемый препарат квинакрин является флуорофором, поэтому эффективность его доставки в инфаркт миокарда будет оцениваться флуоресцентным методом (квинакрин-флуоресценция), что будет являться тераностикой, так как флуоресцентная метка и есть действующее вещество, а полученные результаты будут сопоставляться с результатами спектрофотометрического анализа. Полученные в этих экспериментах данные могут быть использованы в разработке направленной доставки других препаратов (противоопухолевых, антибактериальных).
Будет изучено влияние исследуемых препаратов в связанной с наночастицами форме на постинфарктное ремоделирование в хронических экспериментах на крысах в сравнении с контрольными животными. В этих экспериментах конечными точками будут выступать функциональное состояние левого желудочка после инфаркта, оцениваемая с помощью эхокардиографии высокого разрешения, и степень его ремоделирования – гистологическими методами. Данные результаты позволят оценить эффективность кардиопротекции и безопасность разработанного метода.
В качестве доклинического этапа исследования будет изучен инфаркт-лимитирующий эффект исследуемых препаратов, выбранных на предыдущих этапах, в свободной и связанной с наночастицами форме у свиней. Полученные результаты доклинического исследования позволят рекомендовать использование разработанного способа кардиопротекции в качестве адъювантной терапии при первичном чрескожном коронарном вмешательстве.
Запланированные исследования соответствуют мировому уровню, поскольку в международных базах данных за последние 5 лет имеются научные публикации, посвященные данной проблеме, в рецензируемых журналах, относящихся к категории Q1-Q2 по рейтингу SJR (SCImago Journal & Country Rank). Косвенным доказательством соответствия планируемой работы мировому уровню исследований является наличие положительных рецензий, полученных участниками проекта — авторами публикаций при публикации предшествующих работ, составляющих задел по настоящему проекту, в международных рецензируемых журналах [Sonin D, Pochkaeva E, Zhuravskii S, et al. Biological Safety and Biodistribution of Chitosan Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 2020; 10 (4): 810. https://doi.org/10.3390/nano10040810; Sonin DL, Korolev DV, Postnov VN et al. Silicon-containing nanocarriers for targeted drug delivery: synthesis, physicochemical properties and acute toxicity. Drug Delivery. 2016;23(5):1747-56, DOI: 10.3109/10717544.2015.1069421].
Возможность практического использования запланированных результатов проекта в экономике и социальной сфере велика, поскольку в случае подтверждения ожидаемых результатов на их основе может быть создана технология опытно-промышленного синтеза лекарственных препаратов направленной доставки для лечения ишемической болезни сердца. Возможными потребителями разрабатываемых способов лечения будут пациенты с ишемической болезнью сердца, переносящие острый коронарный синдром. Помимо значительного социального эффекта от применения методики направленной доставки кардиопротективных препаратов, ее внедрение будет сопровождаться существенным экономическим эффектом, связанным с уменьшением затрат на лечение и реабилитацию больных ишемической болезнью сердца.
Результаты работ по проекту будут опубликованы в серии статей в российских и международных рецензируемых журналах. За период выполнения проекта планируется публикация 10 статей, из которых 2 будут опубликованы в российских журналах с импакт-фактором по РИНЦ от 0,2 до 0,8 и 8 — в международных журналах индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science Core Collection) или «Скопус» (Scopus).
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Синтезированы наночастицы альбумина с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего агента и выполнен синтез липосом. Полученные наноносители (наночастицы альбумина и липосомы) с известными физико-химическими свойствами будут использованы в следующем году для направленной доставки квинакрина в зону инфаркта в опытах с ишемией и реперфузией миокарда крыс. Ожидается, что иммобилизация квинакрина на наночастицах альбумина или их инкапсуляция в липосомы позволит увеличить накопление квинакрина в зоне повреждения за счёт повышенной проницаемости сосудов и экстравазации наноносителей, а также снизить побочный эффект квинакрина за счёт уменьшения концентрации его свободной формы в кровотоке. С этой целью проведена иммобилизация квинакрина, кардиогрина и флуоресцеина на наночастицах альбумина двумя методами и проведена инкапсуляция этих веществ в нанолипосомы.
2. Синтезированы наночастицы альбумина в которые инкорпорированы флуорофоры, что позволит провести визуализацию мест накопления наноносителя вместе с действующим веществом, что важно для получения доказательства направленной доставки препарата.
3. Изучена кинетика высвобождения квинакрина с поверхности наночастиц альбумина и из липосом. Полученные денные необходимы для сравнительного исследования эффективности свободной формы действующего вещества и связанной с наночастицей.
4. Нами впервые показано что квинакрин (1 мкг/мл – 5 мкг/мл) и его комбинация с пептидом ПИК7 (10 мкг/мл) оказывают инфаркт-лимитирующий эффект при инфузии в первые 10 минут восстановления коронарного кровотока после 30-минутной ишемии, что выражается в уменьшении зон некроза и no-reflow. Цитопротективный и противовоспалительный эффекты квинакрина хорошо известны, но его эффективность ограничена. Повысить эффективность квинакрина позволит комбинация с пептидом ПИК7 и направленная доставка в зону инфаркта миокарда, что также позволит снизить побочный эффект квинакрина, который проявился в снижении сократительной функции миокарда и объёмной скорости коронарной перфузии на 30%. Связь с наноносителем позволит уменьшить концентрацию свободной формы препарата в кровотоке, что снизит системный эффект препарата.
Установлено, что отдельное введение пептидного препарата ПИК 7 (10 мкг/мл, n = 7) не приводит к значимому уменьшению размера зоны некроза в модели изолированного сердца крысы.
5. Квинакрин и пептид ПИК7 уменьшают проявления феномена no-reflow. Снижение сосудистой проницаемости микроциркуляторного русла миокарда на фоне действия препаратов проявилось в снижении накопления ИЦЗ в зоне некроза и уменьшении площади зоны no-reflow (по уменьшению площади ThS-негативных зон). Уменьшение накопления ИЦЗ в повреждённом миокарде в этих группах проявлялось в уменьшении интенсивности его флуоресценции при наличии флуоресценции в тех же самых зонах ThS (то есть при сохранённом токе перфузата).
6. Получены данные функциональной активности тучных клеток в срезах миокарда, окрашенных толуидиновым синим с дополнительной ИГХ-окраской на химазу и триптазу, который показал тенденцию к увеличению доли неактивных тучных клеток в повреждённом миокарде крыс под действием ПИК7, что подтверждается данными ИФА анализа эффлюента на уровень гистамина, который показал снижение его концентрации в группе квинакрин и группе ПИК7.
7. Смесь квинакрина 1 мкг/мл с этилметилгидроксипиридина сукцинатом (ЭС, 0,1 мг/мл) не уменьшила размер инфаркта миокарда, что, возможно, связано с лекарственным взаимодействием (с натрия метабисульфитом, входящим в состав раствора ЭС).
8. В журнал Biomedical Optics Express подана 8 ноября 2023 года на рецензию статья "Advanced technique of myocardial no-reflow quantification using indocyanine green" авторов: Сонин Д.Л., Папаян Г.В., Истомина М.А., Ануфриев И.Е., почкаева Е.И., Минасян С.М., Зайцева Е.А., мухаметдинова Д.В., Мочалов Д.А., Александров И.В., Петрищев Н.Н., Галагудза М.М.
Ознакомиться со статьёй можно, скачав "Файл с дополнительными материалами" или пройдя по ссылке: https://doi.org/10.1364/opticaopen.24818037.v1.
Журнал Biomedical Optics Express (2022 импакт фактор - 3.4, Q1) индексируется в Web of Science, Scopus и РИНЦ.
Статус статьи - на рецензии. 15 декабря подготовлен препринт:
Sonin, Dmitry; Papayan, Garry; Istomina, Maria; Anufriev, Ilia; Pochkaeva, Evgeniia; Minasian, Sarkis; et al. (2023). Advanced technique of myocardial no-reflow quantification using indocyanine green. Optica Open. Preprint. https://doi.org/10.1364/opticaopen.24818037.v1
Статья посвящена диагностике феномена невосстановленного кровотока (no-reflow) в экспериментальных исследованиях на модели инфаркта миокарда у лабораторных животных. В клинических условиях постишемический феномен no-reflow возникает после первичного чрескожного коронарного вмешательства и наблюдается более чем у половины пациентов. Определяется no-reflow как отсутствие или выраженное замедление дистального коронарного кровотока, несмотря на устранения причины - окклюзии коронарной артерии. Цель исследования заключалась в изучении особенностей визуализации инфаркта миокарда с использованием индоцианина зелёного (ICG) для количественной оценки выраженности феномена no-reflow в эксперименте на крысах в сравнении с тиофлавином S, который является золотым стандартом для визуализации no-reflow в экспериментальных исследованиях. У крыс Wistar выполняли регионарную ишемию миокарда (30 минут) с последующей 2-часовой и 24-часовой реперфузией. Используя двойное окрашивание ICG и ThS и мультиспектральный флуоресцентный органоскоп FLUM, мы регистрировали флуоресценцию ICG и ThS в зоне некроза миокарда, выявляя ICG-негативные зоны, размер которых коррелировал с размером зон no-reflow, обнаруженных ThS. Показано также, что изменение контрастности между зоной no-reflow и неишемическим миокардом отражает выраженность застоя крови, что указывает на то, что ICG-негативные зоны являются зонами no-reflow. Описываемый метод может стать дополнением или альтернативой традиционному методу измерения размеров no-reflow в эксперименте.
Публикации
1. Сонин Д.Л., Почкаева Е.И., Папаян Г.В., Минасян С.М., Мухаметдинова Д. В., Зайцева Е.А., Мочалов Д.А., Петрищев Н.Н., Галагудза М.М. Кардио- и вазопротекторный эффект квинакрина на модели ишемически-реперфузионного повреждения миокарда у крыс in vivo Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, выходных данных ещё нет, но есть письмо из редакции (год публикации - 2023)