КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-15-00289

НазваниеПерепрограммирование В-клеток памяти с целью создания продуцентов человеческих терапевтических монокональных антител

РуководительФилатов Александр Васильевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2023 г. - 2025 г. 

Конкурс№80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-230 - Клиническая (медицинская) иммунология

Ключевые словаВ-клетки памяти, лентивирусная трансдукция, аденоассоциированный вирус, перенос генов, лиганд CD40 рецептора, моноклональные антитела

Код ГРНТИ76.03.55

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Термин перепрограммирование обычно применяется для обозначения возврата зрелых специализированных клеток в состояние индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В нашем проекте мы используем этот термин в отношении методов, которые позволяют при культивировании in vitro направлять дифференцировку клеток в желаемом направлении. В-клетки являются важным звеном иммунитета, они отвечают за выработку антител. В своем развитии В-клетки претерпевают сложный путь дифференцировки от незрелой В-клетки до клеток памяти и плазматических клеток. По сравнению с другими типами иммунокомпетентных клеток дифференцировка В-лимфоцитов остается недостаточно изученным процессом, который плохо поддается моделированию и воспроизведению in vitro. Стимуляция В-клеток с помощью интерлейкинов (IL), а также лиганда рецептора CD40 (CD40L) приводит к образованию плазмобластов, которые через короткое время вступают в апоптоз. Для того, чтобы изменить эту траекторию развития и получить стабильно пролиферирующие и секретирующие В-клетки необходимо их перепрограммировать, например путем введения генов BCL-6 и BCL-XL. Принудительная экспрессия транскрипционного фактора BCL-6 будет обеспечивать устойчивую пролиферацию, а белок BCL-XL защищать от апоптоза. Ранее нами были отработаны условия стимуляции В-лимфоцитов in vitro и трансдукции с помощью лентивирусного вектора с последующим культивированием в течении нескольких месяцев (проект РНФ № 19-15-00331). При этом В-клетки сохраняли фенотип плазмобластов, секретировали Ig и пролиферировали. К сожалению, уровень пролиферации оставался низким, что не позволяло проводить клонирование, а также наращивать значительную биомассу, необходимую для биотехнологической наработки препаративных количеств человеческих моноклональных антител. Для того чтобы добиться стабильной пролиферации В-клеток и получить продуценты человеческих моноклональных антител, мы предлагаем оптимизировать процесс перепрограммирования В-клеток по нескольким направлениям (графический абстракт в файле zajavka.pdf). В качестве источника В-лимфоцитов мы будем использовать периферическую кровь или лимфоузлы. В-лимфоциты после иммуномагнитной сепарации и выделения антиген-специфических клеток мы будем стимулировать in vitro в присутствии IL-21 и фидерных леток, несущих CD40L. В качестве альтернативы будет разработана бесфидерная система, где в качестве CD40L будет использоваться (а) рекомбинантный белок CD40L гексамеризованный адипонектиновым доменом; (б) внеклеточные везикулы, несущие CD40L; (в) бактериофаг Т4, декорированный CD40L. Перепрограммирование CD40L/IL-21-симулированных В-лимфоцитов будет осуществляться с помощью трансдукции вирусами, несущими гены BCL-6 и BCL-XL. Для доставки генов в В-клетки памяти мы будем использовать лентивирусы, псевдотипированные различными белками оболочки (VSV-G, RD114, H/F и BaEV). Большое внимание в проекте будет уделено использованию аденоассоциированных вирусов (AAV) для перепрограммирования В-клеток памяти. Мы сравним по эффективности различные серотипы: AAV2, AAV6, AAV-DJ. Для поддержания стабильной экспрессии генов BCL-6 и BCL-XL мы сравним промоторы цитомегаловируса (CMV) и эукариотический промотор EF-1a. Успешность перепрограммирования В-лимфоцитов мы будем оценивать по фенотипу клеток, а также по продукции антител, которые будем определять методом ELISA, ELISpot и вирус-нейтрализации. Решение поставленных задач позволит получать стабильно пролиферирующие линии В-клеток, секретирующих человеческие моноклональные антитела, которые в последующем будут применяться в иммунотерапии. В перспективе перепрограммирование В-клеток может также использоваться для лечения иммунодефицитных заболеваний, связанных с дефектами в развитии и дифференцировки В-лимфоцитов.

Ожидаемые результаты
Будут определены серотипы аденоассоциированного вируса (AAV), которые наилучшим образом подходят для доставки трансгенов в CD40L/IL-21-стимулированные В-лимфоциты. Будут созданы рекомбинантные аденоассоциированные вирусы, несущий гены BCL-6/BCL-XL, с помощью которых будут трансдуцированы В-клетки памяти. Будет проведено сравнение лентивирусных векторов псевдотипированных различными оболочками по эффективности трансдукции В-клеток памяти. Путем подбора промоторов при трансдукции В-клеток будет оптимизирована экспрессия трансгенов BCL-6 и BCL-XL. Будет создана бесфидерная система активации В-лимфоцитов. В одном из ее вариантов будет использоваться рекомбинантный CD40L, слитый с гексамеризующим доменов белка адипонектина. В альтернативных вариантах CD40L будет представлен или на поверхности внеклеточных везикул или в качестве декорирующего белка на поверхности бактериофага Т4. Будет проведено сравнение В-клеток различной тканевой локализации (В-лимфоциты периферической крови и резидентные В-клетки лимфоузлов) по эффективности перепрограммирования. Будут получены перепрограммированные В-клетки памяти, секретирующие антиген-специфические антитела.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Введение Ранее в нашей лаборатории была разработана методика, с помощью которой B-лимфоциты, выделенные из периферической крови, проявляли активную пролиферацию и вырабатывали IgG в течение 10 дней при стимуляции в системе CD40L/IL-21. На более поздних сроках, В-клетки начинали делится более медленно, прогрессировал апоптоз, и примерно к 15 дню культуры полностью погибают. Целью нашего проекта является перепрограммировании В-лимфоцитов путем переноса генов Bcl6 и Bcl-XL, что позволит предотвратить апоптоз и сохранить пролиферацию активированных В-клеток. Мы предполагаем, что принудительная экспрессия транскрипционного фактора Bcl6 должна обеспечивать устойчивую пролиферацию клеток, а белок Bcl-XL защитит клетки от апоптоза. Результаты Первоначально для трансгенеза мы применяли лентивирусную систему. Для этого были использованы би- и мультицистронные конструкции, содержавшие гены Bcl6 и Bcl-XL, разделенные последовательностью кодирующую саморезрезаемый P2A пептид. Конструкции также включали в себя репортерный ген GFP, отделенный от целевых генов элементом IRES. При использовании двух различных промоторов (цитомегаловируса и эукариотический промотор фактора элонгации трансляции гена EEF1A1) мы наблюдали некоторое увеличение времени роста стимулированной культуры В-клеток, однако примерно через месяц этот эффект терялся и культуры погибали. Укороченные конструкции без GFP и IRES не давали никаких преимуществ. Мы пришли к выводу, что причиной неудач является низкий процент трансдукции, который обеспечивает использования лентивируса. Свои дальнейшие исследования мы сосредоточили на использовании трансдукции с помощью адено-ассоциированного вируса (AAV). Широкому использованию этого подхода препятствует высокая резистентность покоящихся В-лимфоцитов по отношению к инфекции аденоассоциированными вирусами. Нами было обнаружено, что в отличии от покоящихся В-лимфоцитов CD40L/IL-21 активированные В-клетки очень эффективно поддаются трансдукции с помощью AAV, несущих репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Серотипы AAV2, AAV6 и AAV-DJ эффективно и в равной степени трансдуцировали В-лимфоциты, стимулированные смесью, содержащей IL-2, IL-4, BAFF, IL-21 и мультимеризованный CD40L. Наиболее высокую экспрессию трансгена обеспечивал серотип AAV6. Трансдуцированные В-лимфоциты продолжали активно пролиферировать, приобретали фенотип плазмабластов и секретировали Ig в супернатант. По своим функциональным свойствам трансдуцированные В-лимфоциты не отличались от контрольных клеток, которые не подвергались AAV инфекции. В умеренных дозах AAV инфекция не оказывала токсического действия и не влияла на такие физиологические параметры В-клеток как пролиферация В-клеток памяти человека, созревание плазмабластов, продукция и секреция Ig. Эффективная трансдукция наблюдалась в обеих субпопуляциях В-клеток памяти – как с переключенным (IgG+CD27+), так и непереключенным (IgM+CD27+) синтезом Ig. Возможно, что для более эффективной стимуляции В-клеток в бесфидерной системе в коктейль цитокинов необходимо включать некоторые дополнительные факторы. С этой целью мы провели определение спектра цитокинов, которые продуцируются субпопуляциями В-лимфоцитов при CD40L/IL-21 стимуляции in vitro. Нами было обнаружено, что наивные В-клетки секретировали цитокины IL-10, MCP-3, MDC, IL-1a, MCP-1, TNF-α и TNF-β более активно, чем В-клетки памяти. Мы предполагаем, что некоторые из этих цитокинов могут участвовать в аутокринном пути активации наивных В-лимфоцитов, и в последующих исследованиях эти факторы могут быть включены в коктейль стимулирующих добавок. Заключение Доставка трансгенов с помощью AAV является перспективным направлением в инженерии В-лимфоцитов человека. На следующем этапе мы будем использовать AAV для доставки в В-клетки целевых генов Bcl6 и Bcl-XL.

 

Публикации

1. Бязрова М.Г., Михайлов А.А., Сухова М.М., Бардина М.В., Шмидт А.А., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Трансдукция В-лимфоцитов человека с помощью аденоассоциированных вирусов различных серотипов Иммунология, 44 (4): 443-454 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-4-443-454

2. Бязрова М.Г., Порошина А.С., Сухова М.М., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Продукция цитокинов наивными В-лимфоцитами и В-клетками памяти при стимуляции in vitro. Иммунология, 44 (5): 575–585 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-44-5-575-585