КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-15-00468

НазваниеНовые комбинированные полимерные наносистемы доставки противоопухолевых препаратов для таргетного воздействия на опухоли

РуководительКусков Андрей Николаевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2023 г. - 2025 г. 

Конкурс№80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-505 - Технология фармацевтических препаратов и лекарственных форм

Ключевые словаПротивоопухолевый препарат, комбинированное действие, система адресной доставки, наночастица, амфифильный полимер, цитокин, TRAIL DR5-B, рецептор-селективный вариант, наноноситель, поли-N-винилпирролидон, паклитаксел, бортезомиб, куркумин, цисплатин, темозоломид

Код ГРНТИ61.45.15

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Инновационные наноразмерные системы доставки лекарственных препаратов являются актуальным направлением исследований во всем мире. Создание наносистем доставки противоопухолевых препаратов решает фундаментальную задачу преодоления резистентности опухолей, а также прикладную задачу разработки новых терапевтических агентов с повышенной эффективностью и низкой токсичностью. Системы доставки на основе полимеров, формирующих мицеллярные структуры, перспективны благодаря своей способности инкапсулировать гидрофобные активные молекулы внутри ядра мицелл, и одновременно иммобилизовать на поверхности гидрофильные молекулы, обеспечивающие таргетное комбинированное воздействие. Основные принципы конструирования мицеллярных наносистем на основе амфифильных производных поли-N-винилпирролидона (ПВП) ранее разработаны заявителями проекта. Эти системы обладают легко настраиваемыми свойствами, стабильностью и высокой биологической безопасностью. Они эффективны в качестве систем доставки различных терапевтических веществ, например, индометацина, куркумина, терапевтических плазмид, а также могут быть дополнены различными функциональными группами для связывания активных молекул. Также заявителями предварительно была разработана перспективная модель мицеллярных ПВП-частиц, конъюгированных с рецептор-специфичным вариантом противоопухолевого цитокина TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand), показана принципиальная реализуемость и возможность применения такой системы доставки. Целью данного проекта является создание и исследование новых комбинированных мицеллярных наносистем на основе ПВП для таргетной доставки ряда противоопухолевых препаратов. Инкапсуляция гидрофобного препарата в ядро мицелл обеспечит снижение его токсичности и пролонгированное действие; ковалентная конъюгация молекул таргетного модифицированного варианта цитокина TRAIL на поверхности мицелл позволит добиться его опухоле-специфичной адресной доставки и комбинированного противоопухолевого действия. В качестве противоопухолевых препаратов для совместной доставки в опухоли будут в первую очередь исследованы вещества, показавшие значительный синергетический эффект со свободным цитокином (бортезомиб, цисплатин и др.). В отличие от TRAIL дикого типа, разработанный заявителями рецептор-специфичный вариант TRAIL DR5-B связывается исключительно с рецептором смерти DR5 и преодолевает рецептор-зависимую резистентность опухолей к TRAIL. Несмотря на высокую эффективность на линиях опухолевых клеток и на ксенографтных мышиных моделях человеческих опухолей, модифицированный белок TRAIL DR5-B имеет короткий период полувыведения из организма и низкую стабильность в биологических средах. В результате иммобилизации с использованием ПВП-наночастиц будут одновременно улучшены фармакокинетические показатели как низкомолекулярных агентов, так и белковых молекул, что в итоге позволит добиться повышенной эффективности. Наноразмерные системы доставки на основе ПВП – это уникальная российская разработка, не имеющая аналогов в мире. Благодаря легко настраиваемым свойствам ПВП-частиц и методам «клик-химии», применяемым для модификации их поверхности модифицированным цитокином DR5-B, успешный опыт реализации проекта может быть спроецирован на создание аналогичных систем, содержащих противоопухолевый препарат в ядре и альтернативные терапевтические белки или векторные молекулы на поверхности частиц. Кроме того, подходы к получению флуоресцентно-меченых комбинированных ПВП-наночастиц, конъюгированных с заданным таргетным препаратом, позволит найти им применение в качестве агентов для тераностики (препаратов используемых одновременно для диагностики и терапии опухолевых заболеваний). Таким образом, успешная реализация проекта положит основу для создания универсальной наносистемы для адресной доставки заданных терапевтических препаратов и диагностических агентов в конкретные типы опухолей.

Ожидаемые результаты
В результате реализации настоящего проекта будут разработаны перспективные варианты наноразмерных систем на основе биосовместимых синтетических высокомолекулярных соединений (полимеров и сополимеров N-винилпирролидона (ПВП) и их производных) для комбинированной доставки низкомолекулярных противоопухолевых препаратов и таргетных белковых молекул. Будет разработан ряд мицеллярных ПВП-наносистем с вариациями размера, полимерного состава и функциональных групп, в том числе содержащих флуоресцентные метки (диагностические агенты). Будут подобраны оптимальные условия для инкапсулирования различных препаратов в ядро и ковалентной конъюгации цитокина DR5-B на поверхности в зависимости от состава ПВП-мицелл, а также включения в состав таких систем диагностических агентов. В результате будет выбран наиболее перспективный состав мицеллярных ПВП-наносистем по строению, молекулярной массе и функциональным группам полимера, показавший оптимальное сочетание размера, стабильности, физико-химических свойств, простоты получения, биосовместимости и противоопухолевого эффекта. Среди противоопухолевых препаратов будут рассмотрены бортезомиб, цисплатин, куркумин и др. Окончательный выбор препарата будет обусловлен наличием синергетического противоопухолевого эффекта с цитокином TRAIL по экспериментальным и литературным данным, а также эффективностью инкапсуляции в ядро ПВП-наночастиц. Противоопухолевая активность новых комбинированных мицеллярных ПВП-наносистем будет исследована in vitro на 2D моделях опухолевых клеточных линий и 3D моделях мультиклеточных сфероидов, а также in vivo на ксенографтных мышиных моделях человеческих опухолей. Будет проведен сравнительный анализ in vivo эффективности и биосовместимости комбинированных ПВП-наносистем и свободных терапевтических молекул. Эффективность планируемых методик была продемонстрирована авторами в экспериментах по иммобилизации различных терапевтических молекул и плазмид на ПВП-наночастицах, а также по ковалентной иммобилизации молекул противоопухолевого белка DR5-B на поверхности таких носителей. Настоящий проект объединит два ранее апробированных подхода к применению мицеллярных ПВП-наносистем для таргетной доставки терапевтических молекул. Подходы и методы, разработанные в ходе выполнения проекта для создания новых комбинированных наносистем доставки противоопухолевых препаратов и модифицированного цитокина TRAIL, будут служить основой для использования их в качестве универсальной платформы для комбинированной доставки других терапевтических низкомолекулярных и белковых молекул, а также дополнительных диагностических агентов в случае создания препаратов для одновременной диагностики и терапии опухолевых заболеваний (тераностиков). Полученные результаты будут представлены в не менее, чем 10 публикациях в рецензируемых научных журналах, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science Core Сollection), «Скопус» (Scopus) и новом перечне научных журналов из «Белого списка» и могут подлежать правовой охране в качестве результатов интеллектуальной деятельности. Новые комбинированные ПВП-наносистемы доставки смогут стать безопасной и эффективной альтернативой существующим противоопухолевым препаратам благодаря повышенной терапевтической эффективности, контролируемому выделению активных компонентов, биодоступности, пролонгированному действию и сниженной побочной активности. Они позволят заложить технологическую платформу для рационального дизайна и производства новых лекарственных форм, превышающих имеющийся на данный момент мировой уровень разработок в этой области.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В работе были синтезированы амфифильные сополимеры N-винилпирролидона с акриловой кислотой, различного строения. Использование меркаптанов в качестве регуляторов роста и обрыва цепи позволило, с одной стороны, регулировать молекулярную массу образующихся сополимеров и соотношение в них гидрофильной (полимерной) и гидрофобной (алифатической) частей, а, с другой стороны, получать в качестве продуктов синтеза полимеры семителехелевой структуры – содержащие полимерный фрагмент и одну концевую гидрофобную группу, входящую в состав используемого при сополимеризации меркаптана. Строение сополимеров было подтверждено методами 1H и 13С ЯМР спектроскопии, ИК спектроскопии, MALDI-TOF спектроскопии, и было установлено присутствие в макромолекулах полимера звеньев N-винилпирролидона, акриловой кислоты, и одной концевой n-алкильной алифатической группы. Содержание функциональных карбоксильных групп, способных к дальнейшей модификации в данной работе зависело от количества звеньев акриловой кислоты, введенных в процессе полимеризации. Содержание звеньев акриловой кислоты в полимерах регулировалось в диапазоне 1–10 мольн. %. Для дальнейших исследований были получены сополимеры N-винилпирролидона с различной молекулярной массой полимерного фрагмента (2000 - 12000 Да), содержанием карбоксильных групп 1-10 мольн. % и разной длиной гидрофобного концевого фрагмента (С10 – С18). Для всех синтезированных полимеров значения критической концентрации мицеллообразования находились в микромолярном диапазоне, демонстрируя, что данные амфифильные сополимеры способны образовывать стабильные агрегаты даже при низких концентрациях в водных средах. В работе была проведена модификация полученных на первом шаге амфифильных сополимеров с введением в их состав реакционноспособных групп «клик-химии», а именно - малеимидных групп. Строение полученных малеимид-содержащих полимеров было изучено и подтверждено методами 1H и 13С ЯМР спектроскопии, ИК спектроскопии и MALDI-TOF спектроскопии. На следующем этапе получили пустые наночастицы на основе синтезированных и модифицированных амфифильных сополимеров, содержащих дополнительные функциональные группы (карбоксильные или малеимидные), методами самосборки в водных средах. Были изучены основные физико-химические характеристики наночастиц. Для всех исследованных полимеров размер частиц находился в нанометровом диапазоне и составил 100-300 нм, в зависимости от строения используемого полимера, способа получения и ионной силы среды, в которой получали наночастицы. Поверхностный заряд частиц во всех случаях был слабоотрицательным (в диапазоне от -5 до -25 мВ). Исследование морфологии полученных наночастиц методами электронной микроскопии (ТЭМ/СЭМ/АСМ) показало, что они имеют сферическую форму и размеры, лежащие в нанометровом диапазоне. На следующем этапе было проведено включение низкомолекулярных гидрофобных противоопухолевых препаратов (бортезомиб, куркумин, цисплатин) в полимерные наночастицы. Полимерные наночастицы, загруженные бортезомибом, куркумином или цисплатином, получали эмульсионным методом с последующим удалением растворителя под вакуумом, так как этот метод показал наибольшую эффективность при получении ненагруженных наночастиц. Средний размер частиц после ресуспендирования в зависимости от строения используемого полимера составлял от 100 до 600 нм, при достаточно узком распределении по размерам (индекс полидисперсности 0.2–0.3). Поверхностный заряд полученных наночастиц составил от -10 до -25 мВ и также практически не зависел от типа включаемого противоопухолевого вещества. Морфология полученных наночастиц была исследована различными методами электронной микроскопии. Все исследованные образцы наночастиц выглядели как сферические объекты субмикронного размера. Было проведено исследование профиля выделения загруженных терапевтических агентов из частиц в условиях in vitro. Результаты исследования показали, что для всех используемых препаратов наблюдался типичный двухфазный профиль высвобождения. Дополнительно, была показана цитотоксичность полученных наночастиц, загруженных бортезомибом, либо куркумином в отношении линий опухолевых клеток глиобластомы U87 и T98G, и отсутствие существенной цитотоксической активности на линии клеток нормальных фибробластов, что свидетельствует о потенциальной противоопухолевой эффективности и низкой побочной токсичности. Для получения комбинированных наночастиц на основе амфифильных полимеров, был получен противоопухолевый рецептор-селективный вариант цитокина TRAIL DR5-B. Также был получен гибридный белок DR5-B-iRGD с эффекторным пептидом iRGD, ускоряющим проникновение в опухолевые клетки. Для последующей конъюгации с полимерным наночастицами, в аминокислотную последовательность белков DR5-B и DR5-B-iRGD был введен N-концевой аминокислотный остаток цистеина путем замены N-концевого остатка валина V114 на цистеин (V114C) методом сайт-специфического мутагенеза. Все 4 рекомбинантных белка DR5-В, DR5-B/V114C, DR5-B-iRGD и DR5-B-iRGD/V114C были экспрессированы в штамме E.coli SHuffle B и очищены до степени чистоты 98%. На следующем этапе проводили ковалентную конъюгацию полимерных наночастиц на основе сополимеров N-винилпирролидона, содержащих 1–5 мольн. % малеимидных групп, загруженных противоопухолевыми препаратами с рекомбинантными белками DR5-B/V114C либо DR5-B-iRGD/V114C. Средний размер наночастиц, конъюгированных с белками, в проведенных экспериментах, составлял от 250 до 600 нм. Индекс полидисперсности всех частиц не превышал 0.3. Дзета-потенциал всех частиц, модифицированных белкам, находился в диапазоне от -2 до -10 мВ. Таким образом была показана принципиальная возможность получения комбинированных полимерных наночастиц, содержащих в гидрофобном «ядре» различные противоопухолевые препараты и конъюгированных с рекомбинантными белками DR5-B либо DR5-B-iRGD. Были разработаны методики получения флуоресцентно-меченных комбинированных наночастиц на основе амфифильных сополимеров N-винилпирролидона с акриловой кислотой с различной молекулярной массой (2000-12000 кДа) и одной концевой гидрофобной октадецильной группой, содержащих противоопухолевые препараты куркумин или бортезомиб, суспензионным и эмульсионным методом. Полученные флуоресцентно-меченные наночастицы содержащие противоопухолевые препараты, проверяли на основные свойства - размер, форму и дзета-потенциал частиц. Средний размер частиц, полученных суспензионным методом, при увеличении молекулярной массы полимера от 2000 до 12000 Да постепенно возрастал от 150 нм до 250 нм, дзета-потенциал при этом находился в пределах от -5 до -25 мВ. Средний размер частиц, разработанных эмульсионным методом, составлял от 160-270 нм, дзета-потенциал поверхности был равен от -5 до -25 мВ и не отличается от частиц, полученных суспензионным методом. Морфологию наноносителей изучали с помощью электронной микроскопии. Синтезированные частицы имели сферическую форму. Средние значения полученных агрегатов совпадали с данными, полученными динамическим светорассеянием. Стабильность полученных систем проверяли, измеряя размеры наночастиц в растворах методом динамического светорассеяния через разные промежутки времени. Было установлено, что размер частиц оставался практически неизменным на протяжении всех 28 суток, пока проводились измерения. Для изучения профиля скорости выделения флуорофора FITC приготовленные наночастицы растворяли в дистиллированной воде, помещали в диализный мешок с порогом отсечки молекулярной массы 1000 Да. Для исследованных на данном этапе препаратов наблюдался типичный двухфазный профиль высвобождения флуорофора FITC. Полученные результаты свидетельствует о возможности использования полученных наночастиц в качестве основы для систем доставки терапевтических и диагностических агентов различной природы. На следующем этапе проекта планируется исследовать биологическую активность полученных наносистем на 2D и 3D in vitro-моделях опухолевых и нормальных клеточных линий.

 

Публикации

1. Лусс А.Л., Багров Д.В., Яголович А.В., Куковякина Е.В., Хан И.И., Покровский В.С., Шестовская М.В., Гаспарян М.Э., Долгих Д.А., Кусков А.Н. Toxicity evaluation and control release of curcumin-loaded amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone nanoparticles: in vitro and in vivo models Pharmaceutics, - (год публикации - 2024)

2. Яголович А.В., Кусков А.Н., Куликов П.П., Багров Д.В., Петрова П.А., Куковякина Е.В., Исакова А.А., Хан И.И., Покровский В.С., Носырев А.Е., Стамати П.Х., Марквичева Е.А., Гаспарян М.Э., Спандидос Д.А., Тсатсакис А.М. Assessment of the effects of amphiphilic poly(N-vinylpyrrolidone) nanoparticles loaded with bortezomib on glioblastoma cell lines and zebrafish embryos Biomedical Reports, - (год публикации - 2024)