КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 20-15-00120
НазваниеМитохондриальные транспортные системы как фармакологические мишени для коррекции сахарного диабета II типа
РуководительБелослудцев Константин Николаевич, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Марийский государственный университет", Республика Марий Эл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2023 г. - 2024 г. |
Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (45).
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-207 - Эндокринология и обмен веществ
Ключевые словамитохондрии, сахарный диабет, порин, митохондриальная пора, митохондриальный АТФ-чувствительный К+ канал, кальций
Код ГРНТИ76.03.29; 76.03.31; 34.17.27
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Настоящий проект является логическим продолжением ранее реализованного проекта 2020-2022 г.г., направленного на выяснение молекулярных механизмов дисфункции митохондрий при развитии сахарного диабета II типа и изучение возможности коррекции этой патологии с помощью метаболических и фармакологических модуляторов митохондриальных пор и каналов. Актуальность исследований определяется высокой медико-социальной значимостью сахарного диабета (СД) вследствие высоких темпов его распространённости, достигших масштабов мировой эпидемии. Поэтому необходима дальнейшая разработка эффективных подходов к терапии СД. Поскольку нарушение функций митохондрий и связанное с ним развитие окислительного стресса в клетках являются ключевым звеньями патогенеза СД, целенаправленные воздействия на митохондриальные каналы и переносчики могут приводить к клеточному перепрограммированию и ослаблению патологических проявлений СД и его осложнений.
Настоящий проект базируется на результатах исследований, полученных при реализации предыдущего проекта, а именно: 1) на моделях СД у животных и в культуре клеток, ингибитор митохондриальной поры (MPT) алиспоривир подавлял дисфункцию митохондрий и увеличивал скорость утилизации глюкозы из крови; 2) ингибирование VDAC каналов митохондрий с помощью VBIT-4 устраняло митохондриальную дисфункцию в эндотелиоцитах легких мышей при гипергликемии, а снижение уровня экспрессии VDAC1 в фибробластах кожи человека нивелировало последствия гипергликемического стресса. Введение VBIT-4 диабетическим мышам не влияло на прогрессирование СД2 и сопутствующую ему дисфункцию митохондрий; 3) применение уридина (модулятор клеточного метаболизма глюкозы и предшественник активатора митоК-АТФ канала) увеличивало скорость утилизации глюкозы из крови и предотвращало развитие дисфункции митохондрий в миокарде диабетических животных.
Учитывая полученные результаты, в данном проекте планируется развить предложенные нами ранее представления о возможных митохондриальных мишенях для терапевтического воздействия, а также разработать более эффективные подходы для коррекции СД2. В связи с этим, в проекте сформулированы следующие задачи:
1. Исследовать роль предполагаемого компонента MPT поры ANT (аденилаттранслокатор внутренней мембраны митохондрий) в развитии дисфункции митохондрий при диабете. В рамках этой задачи будет исследовано влияние ингибиторов ANT на развитие дисфункции митохондрий и окислительного стресса в культуре клеток в условиях гипергликемии и гиперлипидемии, а также проведена оценка терапевтического действия ингибиторов ANT in vivo на прогрессирование СД и сопутствующей митохондриальной дисфункции в скелетной и сердечной мускулатуре мышей. Параллельно будет определено влияние снижения экспрессии ANT2 на развитие дисфункции митохондрий при гиперлипидемии и гипергликемии в культурах клеток, моделирующих состояние предиабета и диабета.
2. Изучить влияние сниженной экспрессии изоформ VDAC1,2 или 3 в клетках культуры на развитие дисфункции митохондрий и окислительного стресса в условиях гиперлипидемии и гипергликемии. Полученные результаты позволят определить участие разных изоформ VDAC митохондрий в развитии патологических изменений клеток.
3. Оценить влияние ряда синтетических соединений на основе биологически-активных молекул, обладающих антидиабетической активностью (тритерпеновые и фенольные кислоты и их конъюгаты с митохондриально-направленными мотивами (трифенилфосфоний или гуанидин/бигуанидиниевые фрагменты)), на изолированные митохондрии и модельные мембраны. В рамках этой задачи будут определены мембранотропные свойства этих молекул и механизмы их взаимодействия с митохондриями.
Все сформулированные задачи представляют собой логичное развитие исследований предыдущего периода и обеспечивают получение новых фундаментальных результатов, способствующих более глубокому пониманию патогенетических механизмов СД и разработке новых подходов и молекул для терапии данного заболевания.
Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены следующие значимые результаты:
1) На первичной культуре клеток (эндотелиоциты легких мышей), подвергнутых воздействию гиперлипидемии и гипергликемии, будет продемонстрировано влияние ингибиторов аденилаттранслокатора внутренней мембраны митохондрий (ANT) атрактилозида и бонгкрековой кислоты на основные показатели развития митохондриальной дисфункции (изменение мембранного потенциала, восприимчивости к открыванию митохондриальной поры и др.) и окислительного стресса.
2) На модели сахарного диабета II типа у мышей линии C57BL/6 будет установлено, как введение ингибиторов ANT влияет на структуру и функционирование митохондрий сердца и скелетной мускулатуры диабетических животных. Будут изучены эффекты ингибитора ANT (бонгкрековая кислота или атрактилозид) in vivo на параметры митохондриального дыхания и окислительного фосфорилирования, показатель кальциевой емкости и ультраструктурные изменения органелл. Также будет изучено действие ингибиторов ANT на изменения уровня экспрессии генов белков, ответственных за митохондриальную динамику, биогенез, митофагию, а также антиоксидантный статус клеток в тканях животных с диабетом.
3) Будет показано, способно ли снижение уровня экспрессии ANT2 в культуре клеток HEK293T подавлять развитие митохондриальной дисфункции и окислительного стресса в условиях гипергликемии и гиперлипидемии. Полученные на этом и двух предыдущих этапах работы данные позволят установить роль ANT в прогрессировании сахарного диабета, а также определить возможную степень вовлеченности данного белка в патогенез данного заболевания на разных стадиях его развития (предиабет и диабет).
4) Будет продемонстрировано, как снижение экспрессии различных изоформ VDAC (VDAC1, VDAC2, VDAC3) в культуре клеток HEK293T (BT474) влияет на развитие митохондриальной дисфункции и окислительного стресса при экспозиции клеток в условиях гиперлипидемии и гипергликемии. Полученные данные позволят установить возможную степень участия различных изоформ VDAC в патологических изменениях клеток на разных стадиях сахарного диабета. Мы полагаем, что “отключение” разных изоформ может приводить к противоположным эффектам – протекторному действию в отношении гиперлипидемических и гипергликемических нарушений или активирующему действию, усугубляющему их развитие. Полученный результат позволит определить участие VDAC каналов в механизмах патогенеза сахарного диабета II типа.
5) Будет установлено влияние целого ряда биологически-активных молекул, обладающих антидиабетической активностью (тритерпеновые и фенольные кислоты), и их конъюгатов с митохондриально-направленными мотивами (трифенилфосфониевый и гуанидин/бигуанидиниевые фрагменты) на изолированные митохондрии и искусственные мембраны. Основным результатом работы будет являться определение эффекторных мишеней этих соединений в митохондриях, а также молекулярных механизмов их взаимодействия с митохондриальными и модельными мембранами.
Таким образом, настоящий проект является логическим продолжением исследований предыдущего проекта и направлен на дальнейшее развитие предложенных ранее представлений о роли различных митохондриальных транспортных систем в патогенезе СД2 с целью выявления новых молекулярных мишеней, а также разработку более эффективных митохондриально-направленных подходов к терапии СД2. Результаты данного исследования будут полностью соответствовать результатам, получаемым в ведущих лабораториях России и мира. Полученные данные будут опубликованы в форме как минимум 8 статей в высокорейтинговых зарубежных и ведущих российских журналах, индексируемых в базах данных WOS, Scopus и RSCI. Проводимые в ходе выполнения проекта исследования будут способствовать более глубокому пониманию механизмов патогенеза сахарного диабета и выявлению новых перспективных молекул и подходов для терапии данного заболевания. Полученные данные будут способствовать формированию научных и технологических заделов в области здравоохранения, в том числе лечения и профилактики социально-значимых заболеваний, для дальнейшего социального и экономического развития Российской Федерации.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Согласно поставленным в проекте задачам в отчетный период проводилось исследование роли аденилаттранслокатора (ANT) внутренней мембраны митохондрий в развитии митохондриальной дисфункции при гипергликемии и гиперлипидемии. Было исследовано влияние ингибиторов ANT (бонгкрековая кислота и карбоксиатрактилозид) а развитие митохондриальной дисфункции в первичной культуре эндотелиоцитов легких мышей при гипергликемии и гиперлипидемии. Параллельно планировалось определить как снижение экспрессии гена ANT2 в клетках линии HEK293T будет влиять на развитие митохондриальной дисфункции в условиях гипергликемии и гиперлипидемии. В рамках текущего этапа проекта планировалось синтезировать трифенилфосфониевые и гуанидиниевые производные тритерпеновых кислот (урсоловая, маслиновая и коросолиевая) и оценить их митохондриально-направленные и мембранотропные эффекты.
Для решения первой задачи предварительно были подобраны концетрации бонгкрековой кислоты (25 мкМ) и карбоксиатриктилозида (10 мкМ) которые не вызывали клеточную гибель. На первичной клеточной культуре эндотелиоцитов легких мышей была воспроизведена модель гиперлипидемии (0.75 мМ пальмитиновой кислоты в присутствии БСА в течение 48 часов). Продемонстрировано, что в условиях гиперлипидемии наблюдается значительная гибель клеток в культуре (количество клеток снижается практически 80% в течение 6 суток). В основе клеточной гибели при гиперлипидемии может лежать усиленная генерация активных форм кислорода (в 1.6 раза) и митохондриальная дисфункция (падение мембранного потенциала, образование митохондриальных пор и увеличение колокализации митохондрий и лизосом, что может свидетельствовать о митофагии/деградации митохондрий). Установлено, что 25 мкМ бонгкрековая кислота препятствует развитию клеточной гибели (количество клеток в условиях гиперлипидемии снижается на 67%), и ослабляет развитие митохондриальной дисфункции – предотвращает падение мембранного митохондриального потенциала, спонтанное открывание митохондриальных пор (оценка по тушению флуоресценции кальцеина в присутсвии кобальта) и увеличение колокализации митохондрий и лизосом (оценка по колокализации красителей MitoTracker DeepRed FM и LysoTracker Green). Восстановление мембранного митохондриального потенциала наблюдалось и при испльзовании 10 мкМ карбоксиатрактилозида. Это позволяет говорить о том, что регуляция данного параметра может быть связана с ингибированием транспорта адениновых нуклеотидов через внутреннюю митохондриальную мембрану и подавлением митохондриального метаболизма. Вместе с тем, карбоксиатрактилозид усиливал развитие клеточной гибели эндотелиоцитов (количество клеток в условиях гиперлипидемии снижается на 89%) и усиливал генерацию активных форм кислорода (оценка по зонду DCF).
Экспозиция первичной культуры эндотелиоцитов легких мышей в условиях гипергликемии (30 мМ глюкоза в течение 36 часов) также приводила к развитию митохондриальной дисфункции (падение мембранного потенциала, образование митохондриальных пор и увеличение митофагии) и генерации активных форм кислорода. Как и в случае гиперлипидемии 25 мкМ бонгкрековая кислота предотвращала развитие митохондриальной дисфункции. 10 мкМ карбоксиатрактилозид индуцировал развитие окислительного стресса как в условиях нормо- так и гипергликемии. По результатам этой части исследования был сделан вывод, что бонгкрековая кислота способствует защите клеток от гиперлипидемии и гипергликемии. Вследствие этого в 2024 году планируется исследовать влияние бонгкрековой кислоты in vivo на развитие сахарного диабета у мышей. Можно предположить, что данное соединение будет оказывать протекторное действие на развитие данной патологии, митохондриальной дисфункции и окислительного стресса.
В проекте установлено, что митохондрии клеток различных тканей по-разному реагируют на гипергликемический стресс. Так в эндотелиоцитах легких мышей гипергликемия вызывает увеличение числа митохондрий (в 1.75 раза), а также снижение их периметра (в 1.12 раз). В то же время, в культуре фибробластов кожи человека наблюдается достоверное снижение числа митохондрий (в 1.3 раза) и увеличение их периметра (в 1.14 раза). Это явление может лежать в основе адаптации разных тканей к гипергликемии и сахарному диабету.
В соответствии с поставленными в проекте задачами было исследовано, как подавление экспрессии одной из изоформ аденилаттранслокатора (ANT2) влияет на развитие митохондриальной дисфункции в условиях гиперлипидемии и гипергликемии. Для этой цели была получена культура клеток линии HEK293T с пониженной экспрессией ANT2. Установлено, что как в условиях гиперлипидемии (0.5 мМ пальмитиновая кислота в присутствии БСА в течение 48 часов), так и в условиях гипергликемии (30 мМ глюкоза в течение 36 часов) в культуре HEK293T с пониженной экспрессией ANT2 наблюдается усиление генерации активных форм кислорода и спонтанного открывания митохондриальных пор. В условиях гиперлипидемии наблюдается усиление клеточной гибели. Все это позволяет сделать вывод, что снижение уровня экспрессии ANT2 приводит к повышению чувствительности клеток HEK293T как к гипергликемическим, так и гиперлипидемическим условиям. Можно заключить, что снижение экспрессии уровня ANT2 приводит к усилению митохондриальной дисфункции и развитию окислительного стресса в условиях гипергликемии и гиперлипидемии. Вероятно, фармакологическое блокирование данного белка является более щадящим инструментом, который в определенных случаях (бонгкрековая кислота) способна защищать клетки от патологических условий.
В соответствии с поставленными в проекте задачами были синтезированы трифенилфосфониевые и гуанидиниевые производные тритерпеновых кислот (урсоловой, маслиновой и коросолиевой) и оценены их митохондриально-направленные и мембранотропные эффекты. Продемонстрировано, что в отличие исходных соединений большинство гуанидиниевых производных урсоловой кислоты и трифенилфосфониевые производные маслиновой и коросолиевой кислот обладают ярко-выраженным действием по отношению к митохондриям, подавляя процессы окислительного фосфорилирования и стимулируя генерацию активных форм кислорода. При этом гуанидиниевые производные увеличивают Са2+ емкость митохондрий, а трифенилфосфониевые производные ее снижают. В отличие от исходных тритерпеновых кислот, все синтезированные соединения индуцируют проницаемость однослойных лецитиновых липосом для сульфородамина Б.
Таким образом при тестировании исследуемых молекул самой активной являются гуанидиниевое производное G5, которое оказывает влияние как на митохондрии, так и липосомы, а также трифенилфосфониевые конъюгаты коросолиевой и маслиновой кислот.
Все поставленные в отчетный период задачи выполнены. По результатам опубликованы 2 статьи (Q1) и представлен 1 устный доклад на конференции.
Публикации
1. Белослудцев К.Н., Серов Д.А., Ильзоркина И.И.,Старинец В.С., Дубинин М.В., Таланов Е.Ю., Карагяур М.Н., Примак А.Л., Белослудцева Н.В. Pharmacological and Genetic Suppression of VDAC1 Alleviates the Development of Mitochondrial Dysfunction in Endothelial and Fibroblast Cell Cultures upon Hyperglycemic Conditions Antioxidants, 12, 7, 1459 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/antiox12071459
2. Белослудцева Н.В., Серов Д.А., Старинец В.С., Пеньков Н.В., Белослудцев К.Н. Alterations in Mitochondrial Morphology and Quality Control in Primary Mouse Lung Microvascular Endothelial Cells and Human Dermal Fibroblasts under Hyperglycemic Conditions International Journal of Molecular Sciences, 24, 15, 12485 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms241512485
3. Белослудцев К.Н., Старинец В.С., Серов Д.А., Дубинин М.В., Белослудцева Н.В. Дисфункция митохондрий, опосредуемая открытием кальций-зависимой митохондриальной поры, как фактор развития сердечно-сосудистых нарушений при сахарном диабете СБОРНИК ТЕЗИСОВ XXIV СЪЕЗДА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА ИМ. И. П. ПАВЛОВА, 390 (год публикации - 2023)
4. - Ученые из России применили геномный редактор для борьбы с повышением сахара в крови ТАСС, - (год публикации - )
5. - Защита клеток от лишней глюкозы Полит.Ру, - (год публикации - )
6. - СRISPR/Cas9 и молекула-блокатор не дали клеткам погибнуть от избытка сладкого Поиск, - (год публикации - )
7. - Снизить ущерб для клеток от избытка глюкозы помогает блокировка транспортера во внешней мембране митохондрий Сайт РАН, - (год публикации - )
8. - CRISPR/Cas9 и молекула-блокатор не дали клеткам погибнуть от избытка сладкого Indicator, - (год публикации - )
9. - CRISPR/Cas9 и молекула-блокатор не дали клеткам погибнуть от избытка сахара InScience, - (год публикации - )
10. - CRISPR/Cas9 и молекула-блокатор не дали клеткам погибнуть от избытка сладкого Инфарм, - (год публикации - )
11. - Российские учёные предложили редактировать гены для борьбы с диабетом И снижения уровня сахара в крови Ferra.ru, - (год публикации - )
12. - CRISPR/Cas9 и молекула-блокатор не дали клеткам погибнуть от избытка сладкого AI-news.ru, - (год публикации - )
13. - CRISPR/Cas9 и молекула-блокатор не дали клеткам погибнуть от избытка сладкого Сайт РНФ, - (год публикации - )