КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 23-16-00195
НазваниеВыявление физиологических и молекулярных маркеров для поиска засухоустойчивых и высокопродуктивных генотипов в генофонде гуара (Cyamopsis tetragonolоba (L.) Taub.) – исходного материала для селекции отечественных сортов
РуководительВишнякова Маргарита Афанасьевна, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н. И. Вавилова", г Санкт-Петербург
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2023 г. - 2025 г. |
Конкурс№80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии
Ключевые словаГуар (Cyamopsis tetragonolоba (L.) Taub.), засуха, устойчивость, семенная продуктивность, качество семян, камедь, метаболомика, протеомика, молекулярные маркеры, транскриптом, микросимбионты, эффективность симбиоза
Код ГРНТИ34.31.23, 68.35.31, 34.31.37
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Проект направлен на выявление адаптационного потенциала и раскрытие механизмов толерантности к засухе гуара (Cyamopsis tetragonolоba (L.) Taub.) – нетрадиционного для РФ культурного бобового растения многопрофильного использования. Наиболее ценный и стратегически важный продукт, получаемый из семян гуара, - камедь (галактоманнан). Ее используют в качестве присадки для буровых растворов в нефтедобывающей промышленности. РФ зависит от импорта камеди, поскольку основное производство гуара сосредоточено в тропических районах. Гуар — теплолюбивое и нетребовательное к почве растение, характеризуется как умеренно засухоустойчивое. Между тем известно, что при оптимальном влагообеспечении его семенная продуктивность, а также выход и вязкость камеди увеличиваются многократно. В последнее десятилетие российские аграрии приобрели опыт по выращиванию гуара в южных регионах нашей страны, а создание нескольких сортов российской селекции свидетельствует о перспективах производства отечественной гуаровой камеди. Для этого необходимо понять механизмы адаптации растения к определенным условиям среды для эффективного поиска в генофонде гуара генотипов, способных использовать почвенно-климатический потенциал РФ. Для достижения этой цели был инициирован данный проект. Объектом исследования станут образцы гуара из коллекции ВИР, полевое фенотипирование которых будет осуществлено на Волгоградской опытной станции ВИР в закрытом грунте на поливе и без полива. Будут выявлены контрастные по отношению к засухе генотипы, для которых будут детально охарактеризованы связанные со стрессом изменения продуктивности семян и вегетативной массы, выхода и вязкости камеди, паттернов первичных и вторичных метаболитов. Будет проведен анализ аллельного состояния гена засухоустойчивости CtMT1, осуществлен поиск молекулярных маркеров к нему. Будет проанализирован транскриптом семян гуара на разных сроках спелости семян и исследованы профили экспрессии генов, вовлечённых в синтез галактоманнана (камеди). Будет проведён поиск корреляций морфологических и физиологических характеристик засухоустойчивости с экспрессией генов, содержанием индивидуальных белков и метаболитов, что позволит выявить маркерные гены, белки и метаболиты экспрессия/содержание которых ассоциированы с сохранением свойств камеди в условиях засухи. Будет изучено влияние изменений, происходящих и во взаимодействиях гуара с азотфикирующими бактериями при засухе, на интересующие нас параметры продуктивности. Будет исследована способность гуара взаимодействовать и с другим микросимбионтом – грибами арбускулярной микоризы в почвах Нижнего Поволжья, поскольку микоризация помогает растениям противостоять засухе и приводит к увеличению урожайности семян, содержания полезных метаболитов и, вполне вероятно, может привести к увеличению содержания камеди в семенах гуара. Для понимания связи между отдельно анализируемыми событиями будет проведен интегрированный анализ всех полученных данных, что позволит аннотировать метаболические и регуляторные пути, вовлеченные в ответ на засуху. Поскольку «мультиомиксный» подход будет впервые использован для идентификации морфологических, физиологических и молекулярных маркеров системных изменений, происходящих у гуара в ответ на засуху, фундаментальный характер и новизна данного проекта не вызывает сомнений. Его важное практическое значение выражается в разработке предпосылок для маркер-опосредованной селекции гуара – новой стратегически важной для РФ культуры. Познание фундаментальных основ формирования и развития симбиотических взаимоотношений и путей их оптимизации ведет к снижению необходимости применения минеральных удобрений, что имеет значительный экономический и природоохранный эффект. Содержание проекта позволяет быть уверенным в его высокой актуальности и востребованности полученных данных в селекционных и растениеводческих работах для получения и производства новых высокопродуктивных и засухоустойчивых сортов гуара для условий РФ.
Ожидаемые результаты
Генеральная цель данного проекта – с помощью современных платформ постгеномных исследований (метаболомики, протеомики, геномики и транскриптомики) выявить зависимость продуктивности гуара, качества и товарной ценности его семян от засухи в контексте эффективности симбиоза с клубеньковыми бактериями и микоризообразующими грибами на фоне метаболических сдвигов, связанных с адаптацией к водному стрессу. Полученные данные позволят понять механизмы поддержания роста и развития растений гуара, качества семян, включая высокий выход и вязкость камеди в условиях дефицита воды, что очень важно для создания засухоустойчивых высокопродуктивных сортов этой новой стратегически важной для РФ культуры. Общепринятое в настоящий момент представление о засухоустойчивости как о способности растения сохранять динамику прироста биомассы при устойчивом снижении водного потенциала среды, к сожалению, не учитывает часто имеющее при этом место снижение семенной продуктивности и ухудшение товарного качества семян. В случае гуара это означает не только потерю питательной ценности семян, но и снижение выхода камеди и, возможно, ухудшение ее качества (вязкости). Сравнение различных генотипов, отличающихся по степени выраженности этих негативных изменений в ответ на одну и ту же величину стрессорного воздействия (т.е. степени снижения водного потенциала субстрата и тканей растения) позволит понять, какие изменения метаболизма и/или работы регуляторных систем лежат в основе наблюдаемых изменений фенотипа. Выявление изменений в растительно-микробных взаимодействиях, имеющих место под воздействием засухи, позволит сделать важнейший шаг к пониманию механизмов, лежащих в основе подавления клубенькового симбиоза в условиях дефицита влаги. Анализ вклада микоризации корней растений в развитие устойчивости к засухе позволит разработать рекомендации по применению препаратов на основе арбускулярной микоризы (АМ) для инокуляции растений гуара в полевых условиях. Генотипирование изучаемых образцов гуара из коллекции ВИР инициирует поиск молекулярных маркеров засухоустойчивости и позволит заложить основы для селекции гуара, основанной на такого рода новых маркерах. Интегрированный анализ всех полученных данных о различных участниках предполагаемых регуляторных путей, позволит аннотировать индивидуальные регуляторные и/или эффекторные молекулы. Так как эти знания подразумевают шаг вперед в понимании взаимодействия регуляторных систем растения в контексте стресс-индуцированных метаболических сдвигов, фундаментальное значение предлагаемого проекта очевидно. Поскольку работы по получению метаболомных, геномных и транскриптомных ресурсов гуара в мире находятся в стартовом состоянии, выявление характера таких взаимодействий, безусловно, будет достижением мирового уровня. Понимание выявленных закономерностей позволит правильно определить необходимое направление отбора, адекватно подобрать молекулярные маркеры для селекции и получить в итоге новые засухоустойчивые сорта гуара, характеризующиеся высокой семенной продуктивностью и сравнительно высоким выходом камеди. Это особенно ценно для интродуцирования в растениеводство Российской Федерации новой сельскохозяйственной культуры стратегического значения. Понимание механизмов засухоустойчивости и адекватная оценка адаптивного потенциала гуара позволит более адресно выбирать агроклиматические зоны для его производства. Это обусловит получение стратегически важного продукта со сниженной себестоимостью (за счет применения микробных и снижения применения минеральных удобрений) и снизит потребности в импорте камеди – дорогостоящего продукта индийского и пакистанского производства, т.е. поможет решить проблему импортозамещения в отношении этого ценнейшего ресурса. Это должно повысить экономическую эффективность аграрного и нефтедобывающего секторов страны, что позволяет нам быть уверенными в высоком социально-экономическом потенциале предложенной в рамках данной заявки идеи.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проект направлен на выявление адаптационного потенциала гуара (Cyamopsis tetragonolоba (L.) Taub.) – нетрадиционного для РФ бобового растения многофункционального использования, которое в последние годы интродуцируется в РФ и входит в список стратегически важных культур, т.к содержит в семенах камедь. Гуар считается умеренно засухоустойчивым растением. Для адресной акклиматизации его в РФ необходимо изучить генофонд культуры по степени толерантности к засухе и понять ее механизмы. Поиск молекулярных маркеров к генам, определяющим засухоустойчивость будет содействовать маркер опосредованной селекции, установленные изменения в метаболизме растений при реакции на засуху выявят физиологические маркеры устойчивости к стрессору.
В качестве изучаемого материала из коллекции ВИР выбрано 50 образцов, максимально полно отражающих генофонд культуры по происхождению, селекционному статусу, разнообразию характеристик растений.
Основной экспериментальной площадкой было поле на Волгоградской опытной станции ВИР, где проводили фенотипирование образцов по 15 селекционно значимым признакам. Для избежания попадания осадков экспериментальное поле было защищено полиэтиленовым тентом. Применяли режимы капельного орошения (П-полив) и прекращения орошения в фазу формирования последних бобов в первом узле (искусственная засуха - З). По всем изученным признакам вычислены описательные статистики, осуществлено сравнение признаков структуры урожая в двух режимах – П и З - методами дисперсионного и факторного анализов. Выявлена значительная изменчивость большинства изученных признаков по всем образцам, как межсортовая, так и в пределах образцов. По результатам фенотипирования создана описательная база данных.
Определены признаки, показывающие в обоих режимах вариабельность средней степени: высота растения, длина боба, число семян в бобе и масса 1000 семян. Они детерминируются в основном генотипом образца, условия среды на них влияют слабо. Признаки продуктивности, наоборот, значимо связаны с условиями произрастания.
Методом главных компонент (РСА) определены факторные нагрузки на признаки, достоверно вносящие наибольший вклад в продуктивность растений: число узлов и зрелых узлов, масса зрелых бобов с растения и масса созревших семян с растения.
Вычисленные средние значения признаков каждого образца по обоим режимам опыта обнаружили неожиданные результаты: продуктивность образцов гуара оказалось выше на засухе, чем при поливе, в частности по общему числу узлов и числу зрелых узлов на растении, массе зрелых бобов и массе созревших семян с растения, массе 1000 семян. Это свидетельствует об отрицательном влиянии полива, а именно об избытке увлажнения посредством проводимого нами капельного орошения - около 0,8 л/ч раз в неделю в течение 5 часов.
Коэффициент варьирования признаков продуктивности в режиме засухи у большинства показателей был меньше, чем у растений на поливе.
По показателям высокой семенной продуктивности на режиме засухи определены образцы, которые мы считаем устойчивыми к этому стрессору. Образцы с минимальной семенной продуктивностью – неустойчивыми. Образцы с максимальной семенной продуктивностью на режиме полива, некоторые со сравнимой на режиме засухи, можно считать толерантными к переувлажнению. Образцы высокопродуктивные на обоих режимах – П и З - можно назвать образцами с широкой адаптацией к условиям увлажнения.
Таким образом, подбор условий полива в сочетании с селекцией на признак засухоустойчивости позволит достичь максимального прироста продуктивности.
Через три недели после прекращения полива у каждого образца были оценены физиологические и биохимические параметры, позволяющие охарактеризовать степень засухоустойчивости гуара (устьичная проводимость, активность фотосистемы II, содержание хлорофиллов, оценено содержание веществ, реактивных в отношении тиобарбитуровой кислоты), а также морфологические изменения, потенциально связанные с действием засухи. На основе полученных данных, было выявлено по пять образцов, характеризующихся наиболее и наименее выраженной устойчивостью к действию засухи. Каждая из этих групп характеризовалась выраженным паттерном физиологических реакций.
Осуществлена подготовка к генотипированию определенных как контрастные по отношению к засухе 10 образцов гуара и произведена идентификация гена металлотионеина CtMT1 в исследованном материале, что отражено в результатах ПЦР-амплификации. Выделена тотальная ДНК из проростков и определено качество ее фракций в 1,5%-м агарозном геле. Концентрации образцов ДНК измерены спектрофотометрически. Продукты амплификации имели варьирующуюся длину от 40 до 70 п.н., что может свидетельствовать о генетической вариабельности или наличии различных изоформ этих генов в геноме гуара.
Вегетационный опыт по инокуляции 4 образцов гуара – двух устойчивых к засухе и двух не устойчивых – штаммом ризобий Bradyrhizobium retamae RCAM05275 (патент сотрудников ВНИИСХМ) в режимах П и З. Выявлено наличие комплементарного взаимодействия использованного штамма со всеми образцами, приводящее к образованию на корнях азотфиксирующих клубеньков, увеличению высоты и биомассы растений и массы корней. Очевидное образование клубеньков было на растениях в опыте с инокуляцией на поливе (И*П) в среднем по образцу от 3,67 до 20,33 шт/растение. В варианте инокуляция-засуха (И*З) клубеньков было значительно меньше (3-5,75 шт.), мелкие слабо различимые. Одновременно в варианте И*З наблюдалось снижение значений высоты и массы растений по сравнению с вариантом И*П.
Нитрогеназная активность (мкм С2Н4/растение/час) была максимальной в варианте И*П, сравнительно низкой в варианте И*З. Удельная нитрогеназная активность на единицу биомассы клубеньков (мкм С2Н4/1 г клубеньков/час) также была выше в варианте И*П по сравнению с вариантом И*З. Таким образом, засуха оказала негативное воздействие на становление симбиотических взаимоотношений гуара с азотфиксирующими бактериями.
Для детекции экспрессии гена СtMT1 осуществлено выделение РНК специальными наборами, но несколько попыток были безрезультатными. Успешным оказалось использование экстрагирующего буфера на основе СТАВ (Cetlytrimethylammonium Bromide). Качество полученных образцов РНК было оценено спектрофотометрически и при помощи метода гель-электрофореза. Электрофорез в 1% агарозном геле показал четкое разделение полос 28S и 18S рРНК, а спектрофотометрические характеристики препарата свидетельствовали об отсутствии загрязнения.
Проведен микроскопический анализ наличия арбускулярной микоризы (АМ) в корнях четырех образцов гуара, выращенных в Волгограде, - двух устойчивых к засухе и двух неустойчивых. Выявлено присутствие колоний грибов АМ, как минимум, двух морфотипов в корнях всех четырех генотипов. Также обнаружено наличие образований, сходных с гифами и микросклероциями у относительно недавно выявленной группы полезных эндофитных грибов, т.н. «темных септированных эндофитов» (от англ. “dark septate endophytes”). С целью выявления наличия/отсутствия генетического полиморфизма в отношении признака интенсивности колонизации корней грибами АМ, а также выявления связи между устойчивостью генотипов к засухе и способностью к поддержанию симбиоза с грибами АМ, проведен двухфакторный дисперсионный анализ (тест Тьюки) по факторам «устойчивость к засухе» и «условия полива». Выявлено, что фактор «условия полива» не влияет ни на один из определяемых параметров развития АМ. В то же время фактор «устойчивость к засухе» повлиял на параметры, характеризующие развитие арбускул и везикул. Генотипы, обладающие низкой устойчивостью к засухе, образовывали большее количество арбускул и везикул, по сравнению с генотипами, устойчивыми к засухе.
Полученные результаты важны как для оптимизации процесса поиска исходного материала для селекции засухоустойчивых сортов (определение оптимального фона увлажненности почвы в качестве контроля к засухе), выбора физиологических параметров для дальнейшего скрининга, так и в осуществлении подходов к маркер-опосредованной селекции.
Публикации
1. Вишнякова М.А., Фролова Н., Фролов А. Drought Stress Response in Guar (Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub): Physiological and Molecular Genetic Aspects. Plants. 2023; 12(23):3955. https://doi.org/10.3390/plants12233955 Plants, Vishnyakova MA, Frolova N, Frolov A. Drought Stress Response in Guar (Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub): Physiological and Molecular Genetic Aspects. Plants. 2023. Volume 12 Issue 23: 3955c (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/plants12233955