Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проведено формирование группы перспективных генов, которые могут иметь роль в процессе локального чекпойнта. Получены мутанты по генам: ies6, ies5, nhp10, которые регулируют последнюю стадию репаративной сборки хроматина. Для этой цели использовали штаммы KFY803, KFY1437, KFY827 из международной коллекции делеционных штаммов дрожжей, несущие разрушенные гены nhp10, ies6 и ies5. Затем синтезировали праймеры 5' - gctaagaaatcttgtgcacga - 3' и 5' - taggaatcgtctgcccacgt - 3'. комплементарные последовательностям правого и левого фланга разрушенного гена nhp10 (ген nhp10 заменен на URA3 ген). При этом ген URA3 окружали последовательности длиной примерно 100 нуклеотидов каждая комплементарные окружению гена NHP10. Из штамма KFY803 была выделена геномная ДНК и с помощью ПЦР получен фрагмент ДНК, несущий ген URA3, фланкированный последовательностями ДНК комплементарными флангам гена NHP10. Эти фрагменты были методом литиевой трансформации введены в клетки штамма LMG-3031 (MATα ade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160,188 trp1) из коллекции лаборатории Экспериментальной генетики ПИЯФ. Трансформированные клетки в течение пяти дней выращивали на селективной среде без урацила. Затем отсевали выросшие колонии и методом ПЦР проверяли правильность встраивания маркерного гена URA3 на место гена NHP10. С использованием подобной методологии и праймеров 5' - ggc tct ctg tgc gaa gga ag - 3' и 5' - gag act ggc atc cat gca tg - 3' из штамма KFY1437 перенесли маркерный ген KanR на место гена IES6. Отобранный мутант получил название ТАЕ-202. С использованием праймеров tga ctg cga tga ctc tag cg - 3' и cgg ttt aag cca cat gtt agg - 3' из штамма KFY827 перенесли маркерный ген NAT на место гена IES5. Проведены эксперименты по сравнительному анализу частоты УФ-индуцированного мутагенеза при низких дозах (14 Дж/м2) у штамма дикого типа и одиночных мутантов him1, hsm3, hsm6, hif1, ies6, ies5, nth10, rad30, rpd3, pms1. Результаты представлены в Таблице1. Таблица 1. Частота УФ-индуцированных canR мутаций х10-5 Доза WT him1 hsm3 hsm6 hif1 ies6 ies5 nth10 rad30 rpd3 pms1 14 Дж/м2 3 8 14 6.5 15 0,4 9.6 10,2 19 4 3,5 Проведен эксперимент по сравнительному анализу частоты УФ-индуцированного мутагенеза при высоких дозах у штамма дикого типа и одиночных мутантов ies5 и nth10. При дозе 160 Дж/м2 частота мутаций у WT – 30 х10-4; у ies5 - 29 х10-4; у nth10 - 47 х 10-4. Частоту мутагенеза у ies6 не анализировали, та как он не прошел первый этап отбора. По результатам проведенных анализов из дальнейшей работы был исключен только мутант ies6. Для более точного отбора необходимых мутантов был проведен анализ спонтанного репаративного мутагенеза, который фиксирует эффект ультра-малых количеств повреждений ДНК. Таблица 2. Частота спонтанных репаративных мутаций х10-7 WT him1 hsm3 hsm6 hif1 ies5 nth10 rad30 rpd3 pms1 3,5 14 54 24 72 4,4 20 31 8 50 Как видно из Табл. 2 наиболее чувствительными к ультра-малым уровням повреждений ДНК оказались hsm3, hif1, rad30 и pms1. Пара мутаций hsm3 и hif1 приводят к отсутствию двух вспомогательных субъединиц комплекса NuB4, осуществляет ацетилирование гистонов и участвует в качестве шаперона в сборке хроматина. С помощью методики разрушения генов были получены двойные мутанты: rad30 pms1, rad30 ies5, rad30 hif1 и rad30 hsm3, двойной мутант ies5 rpd3 был взят из коллекции лаборатории. Наибольший интерес представляет двойной мутант rad30 pms1. Ген RAD30 кодирует репарационную полимеразу Polη, которая осуществляет синтез через пиримидиновые димеры ДНК, индуцируемые УФ, с достаточно высокой точностью, осуществляя тем самым безошибочную ветвь пути синтеза через повреждения по механизму, опосредующему толерантность клеток к повреждениям ДНК. Мутация rad30 оставляет в клетке только высоко ошибочную ветвь синтеза через повреждения ДНК, контролируемую полимеразой Polζ. Ген PMS1 кодирует эндонуклеазу, которая является ключевым ферментом в мисматч репарации. Этот путь репарации работает с неправильно спаренными натуральными основаниями. В данной работе мы показали, что при низких дозах УФ (14 Дж/м2) частота мутаций у мутанта rad30 в 6 раз выше, чем у штамма дикого типа. Каков механизм этого повышенного мутагенеза? Единственным источником появления мутаций в rad30 является полимераза Polζ, которая ответственна за случайное встраивание нуклеотида над повреждением ДНК. Polζ обладает достаточно высокой точностью синтеза на неповрежденной матрица, но из-за отсутствия у нее редакторской активности по точности синтеза она на два порядка уступает репликативным полимеразам. После встраивания случайного основания над повреждением Polζ в принципе может продолжить синтез ДНК при заполнении бреши, образовавшейся в сайте повреждения при репликации. Чтобы подтвердить или опровергнуть эту возможность, мы использовали двойной мутант rad30 pms1. Если частота мутаций в двойном мутанте будет выше, чем аддитивный эффект одиночных мутаций, значит дополнительные мутации возникли из-за ошибок Polζ при работе на неповрежденной матрице в ходе заполнения бреши. Мы провели эксперименты с двойным мутантом rad30 pms1 и показали что при минимальной дозе УФ 14 Дж/м2 частота индуцированных мутаций составила 40 х10-5 в два раза выше, чем в одиночном rad30. Одиночный pms1 при этой дозе УФ практически не отличался от штамма дикого типа. Таким образом, можно заключить, что Polζ может участвовать в заполнении брешей при репарационном синтезе. Ген IES5 кодирует одну из субъединиц большого ремодулирующего комплекса, который принимает участие в завершающей стадии репаративной сборки хроматина. Мутация ies5, практически, не влияет на УФ-мутагенез при высоких дозах, однако при низкой дозе облучения выход мутаций увеличился в три раза по сравнению с штаммом дикого типа. Двойной мутант rad30 ies5 показал частоту мутаций при минимальной дозе УФ равную 32 х 10-5, что соответствует аддитивному увеличению частоты мутаций (Табл.1). Таким образом, гены IES5 и RAD30 оба участвуют в регуляции локального чекпойнта по независимым механизмам. Гены HSM3 и HIF1 кодируют вспомогательные субъединицы комплекса NuB4 и их инактивация приводит к некорректной сборке нуклеосом, что в свою очередь приводит к неполной активации чекпойнтной киназы Rad53. Последнее приводит к привлечению часто ошибающейся Polη в течении заполнения репаративных брешей ДНК и повышенному выходу мутаций.При больших дозах мутация rad30 супрессирует УФ-специфический мутагенез hms3 и hif1 одиночных мутантов. В двойном мутанте rad30 hsm3 частота мутаций при низкой дозе УФ составила 18 х10-5, что совпадает с одиночным мутантом rad30. В двойном мутанте hif1 rad30 частота мутаций составила 35 х 10-5, что выше, чем в любом из одиночных мутантов. Таким образом, комбинация мутаций hms3 и rad30 супрессирует hms3-специфический УФ-мутагенез, в то время как комбинация hif1 и rad30 приводит к аддитивному эффекту, что пока трудно объяснимо. Ген RPD3 кодирует деацетилазу, которая деацетилирует гистоны в течение репарационной сборки хроматина. Предполагается, что комплекс RPD3 принимает участие на предпоследней стадии сборки хроматина. Мутация rpd3 увеличивает частоту УФ-индуцированного мутагенеза при больших дозах примерно в !,5 раза, но,практически, не изменяет уровень УФ-мутагенеза при низких дозах (табл. 1) и только в два раза увеличивает частоту мутаций при ультра-низких уровнях повреждений ДНК. Двойной мутант rpd3 ies5 показал частоту УФ индуцированного мутагенеза 6,5 х10-5, что ниже частоты одиночного мутанта ies5. Таким образом, отсутствие в клетке деацетилирования гистонов, опосредованное мутацией rpd3, слабо интерферирует с мутацией ies5 в репарационной сборке хроматина при малых дозах УФ.