КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 23-24-00201
НазваниеИсследование фауны наземных тихоходок России
РуководительТуманов Денис Владимирович, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2023 г. - 2024 г. |
Конкурс№78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-101 - Зоология
Ключевые словаТихоходки, биологическое разнообразие, ДНК-баркодинг, фаунистика, систематика, филогения, метагеномика
Код ГРНТИ34.33.15
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Биоразнообразие является уникальным и во многом невозобновимым ресурсом для любой страны, и его объем и значимость для территорий масштаба Российской Федерации сложно переоценить. В России приоритетность исследований биоразнообразия закреплена в ряде государственных научных программ, таких как программа «Научные основы сохранения биоразнообразия России», «Биологическое разнообразие России».
Тихоходки – древняя группа беспозвоночных животных, рассматриваемая как отдельный таксон высокого ранга (тип). Тихоходки являются процветающим таксоном, заселившим практически все существующие на Земле экотопы. Это – микроскопические животные; размер самых крупных видов не превышает полутора миллиметров. В наземных локациях тихоходки могут достигать значительной численности, играя важную роль в функционировании сообществ, особенно тех, в которых мохово-лишайниковая растительность является доминирующей (например, арктические тундры) составляющие существенную часть территории РФ. Тихоходки демонстрируют массу уникальных адаптаций, многие из которых помимо фундаментального представляют и совершенно практический интерес. Они выработали уникальные формы и механизмы анабиоза, по разнообразию которых эта группа не имеет себе равных. Многие аспекты этой устойчивости имеют перспективное практическое применение.
В последние десятилетия радикально поменялся подход к изучению видового разнообразия организмов, в результате чего ранее накопленная информации о локальных фаунах утратила большую часть своей научной значимости. С внедрением в практику исследований современных методов молекулярной таксономии и интегративного подхода на смену концепции широко распространенных изменчивых видов пришла концепция локальных, хорошо обособленных близких видов. Для тихоходок, в частности, показано, что практически все «широко распространенные виды», ранее так или иначе указанные для фауны России являются комплексами видов. В этой ситуации изучение разнообразия тихоходок России следует практически начать заново. Достаточно сказать, что на сегодняшний момент для всей территории России имеется лишь три опубликованных работы, в которых корректно использованы современные методы исследования, включая ДНК баркодинг, в них показано наличие на территории России всего лишь трёх видов тихоходок.
В рамках предлагаемого проекта мы планируем впервые систематически, с широким охватом применить молекулярно-биологические методы для изучения видового разнообразия наземных тихоходок на территории Северо-Запада России. Мы планируем статистически оценить число проб, необходимое для получения достаточно полного представления о видовом составе тихоходок, обитающих на изучаемой территории, и разработать методические рекомендации для фаунистических исследований. Выполнение проекта позволит впервые получить современные данные по таксономическому разнообразию тихоходок России, основанные как на современных морфологических так и молекулярных данных, описать новые виды и провести интегративное переописание целого ряда видов, ранее известных с территории РФ. На основе полученного набора ДНК-баркодов будут разработаны праймеры для метабаркодинга тихоходок. Предлагаемые исследования будут являться развитием новой для коллектива научной тематики, связанной с молекулярной фаунистикой и ДНК-баркодингом, логически выросшей из предшествующих исследований коллектива в области морфологической систематики и фаунистики , а также молекулярной филогенетики тардиград. По результатам исследования впервые будут созданы современные определительные ключи для идентификации видов тихоходок Северо-Запада РФ, дополненные атласом микрофотографий, и база ДНК-баркодов, что позволит проводить надежное определение видов тихоходок не только специалистам систематикам, но и широкому кругу исследователей. Реализация проекта подготовить когорту молодых специалистов, которые будут способны развивать дальнейшие исследования тихоходок и других микрометазоев на современном научном уровне.
Ожидаемые результаты
1. Будут получены первые надежные и современные данные о разнообразии наземных тихоходок на Северо-Западе России. Морфологическая идентификация обнаруженных видов будет подтверждена методами ДНК-баркодинга, что позволит не только повысить точность таксономической атрибуции обнаруженных форм, но и впервые получить данные по генетическому разнообразию видов, популяции которых будут обнаружены в различных регионах России, и сравнить их с имеющимися данными для видов мировой фауны. Крайне слабая изученность фауны тихоходок России и имеющиеся у коллектива предварительные данные позволяют с уверенностью предположить, что в ходе работы будет обнаружено и описано значительное число новых для науки видов, что внесет существенный вклад в изучение разнообразия группы в целом. Результаты исследования предполагается использовать для подготовки сводки по фауне тихоходок Северо-Запада России, снабженной определительными ключами, атласом микрофотографий, данными по последовательностям ДНК-баркодов и методическими рекомендациями по проведению фаунистических исследований. В настоящее время существуют только ключи для определения пресноводных тихоходок, в то время как подавляющее число видов тардиград связано с наземными местообитаниями. До настоящего времени в мировой литературе нет вообще ни одной фаунистической сводки по тихоходкам, основанной на результатах исследования с использованием современных методов интегративной таксономии, сочетающих в себе сбалансирование применение молекулярных и морфологических методов исследований. Подобные исследования только начинают развиваться, и в этом отношении предлагаемая работа находится на острие современных исследований биоразнообразия, проблемы соотношения морфологических и молекулярных видов и современной зоологической таксономии. Эта работа исключительно важна для систематики тихоходок в целом, так как из-за неполноты и неясности диагнозов видов, описанных в начале прошлого века, к ним впоследствии часто относили формы, обнаруженные в других регионах мира. Корректное переописание этих видов, в особенности с использованием материала из типового местообитания, выполненное с применением современных морфологических и молекулярных методов позволит во многом по-новому взглянуть не только на вопросы систематики и разнообразия, но и на проблему мировой зоогеографии и вопросы построения глобальной модели распределения видов тихоходок в окружающей среде. В этом отношении полученные результаты будут крайне интересны и в глобальном контексте анализа характера пространственного распределения микроскопических организмов обладающих высокоустойчивыми покоящимися стадиями (так называемая убиквисткая / биогеографическая модели распространения микроорганизмов). Опубликование такой работы позволит активно использовать данные по этой группе в работе специалистов по экологическому мониторингу, при изучении структуры сообществ почвенных микрометазоа, а так же обоснованно подходить к выбору таксонов при планировании углубленных физиологических и молекулярно-биологических исследований практической направленности. Появление современной и доступной работы по фауне тихоходок России так же несомненно будет способствовать привлечению молодых ученых к работе в этой перспективной области, поскольку наблюдаемый в последние годы всплеск интереса к тихоходкам среди студентов и начинающих исследователей в значительной степени тормозится отсутствием доступных и достоверных определителей, методических рекомендаций и данных по фауне России, на которые можно было бы опираться при планировании работы.
2. С использованием статистических методов и специализированных программных пакетов будет сделана попытка оценить число проб различных субстратов, обеспечивающее получение наиболее полного представления о фауне тихоходок исследуемого региона, что позволит свести к минимуму избыточный сбор проб в ходе дальнейших исследований. Учитывая значительные временные затраты на разбор каждой пробы, это позволит значительно интенсифицировать фаунистические исследования и в перспективе удешевить и ускорить проведение подобных исследований. Разработка стандартного протокола исследования видового разнообразия тихоходок позволит в будущем обоснованно планировать объем работ по сбору материала и проводить достоверное сравнение фаун различных регионов, избегая ошибок, связанных с недостатком данных.
3. В результате исследований будут получены наборы последовательностей маркерных генов COI и ITS-2 по всем основным группам тихоходок наземной фауны. С использованием ДНК-баркодов для наиболее распространенных видов будет проведен филогеографический анализ, который позволит впервые выявить закономерности распределения видов тихоходок на территории Северо-Запада России, пути формирования фауны и возможные события непреднамеренной интродукции. Полученные молекулярные данные позволят проанализировать генетическую структуру широко распространенных видов тихоходок и сделать выводы о существовании и генетических отличиях так называемых "скрытых видов" в пределах этой группы микрометазоев, а предлагаемый в проекте интегративный подход к анализу данных - сделать мотивированные заключения о таксономическом статусе обнаруженных генетических линий. Подобные исследования тихоходок (равно как и других микрометазоа) находятся лишь в самом начале своего развития, их выполнение позволит нашей группе уверенно занять лидирующие позиции в этой области исследований.
4. Будет создана первая справочная таксономическая коллекция постоянных препаратов тихоходок фауны Северо-Запада России, которая послужит основой для дальнейшей фаунистической и таксономической работы на территории РФ и в мировом масштабе. Будет создана база ДНК-баркодов видов тихоходок, что позволит в будущем избежать обычных трудностей при идентификации исследованных видов, связанных с особенностями таксономической работы с тихоходками: возможно будет обойтись без использования дорогостоящего высокотехнологичного микроскопического оборудования для изучения тонких деталей строения когтей и кутикулы взрослых особей, доступного далеко не всем исследователям. Отпадет также необходимость поиска в пробах отложенных яиц тихоходок, исследование структуры хориона которых необходимо для видовой идентификации во многих группах Eutardigrada. Будут разработаны праймеры для выявления видового разнообразия тихоходок методом метагенетического анализа ДНК окружающей среды. Выполнение предложенного проекта позволит поднять на новый, современный уровень таксономическую идентификацию тихоходок, а дальнейшее развитие подобного подхода позволит во многом упростить эту работу и сделать ее гораздо более точной, особенно в руках неспециалистов и вовлечь тихоходок в изучение структуры и функционирования наземных экосистем.
5. В ходе работы будут получены значительные данные по последовательностям 18S и 28S рРНК тихоходок. В дальнейшем они будут использованы для проведения широкомасштабного филогенетического анализа, что позволит значительно улучшить наше понимание взаимосвязей и путей эволюции надвидовых таксонов тихоходок. Систематика тихоходок на уровне родов и семейств в настоящее время находится в стадии перестройки, вызванной вовлечением в филогенетические построения молекулярных данных. Однако далеко не все надвидовые группы тихоходок исследованы в этом отношении, и появление новых данных будет существенным вкладом в построение новой системы типа Tardigrada.
6. Будет подготовлена группа молодых учёных, обладающих значительным опытом таксономической работы с трудной в методологическом отношении группой микрометазоа, с использованием всех современных методов морфологического и молекулярно-генетического анализа. Выполнение подобных исследований будет очень хорошей школой современной морфологической и молекулярной работы и введением в интегративную таксономию для студентов и аспирантов, что в перспективе позволит подготовить в России целую группу молодых специалистов по работе с микрометазоями.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе полевых выездов членами коллектива собрана коллекция субстратов содержащих тихоходок из Ленинградской области, Калининградской области и республики Карелия. Всего 228 проб.
Так же в распоряжение исследовательской группы переданы материалы сборов на полуострове Камчатка, на Кавказе, в Прибайкальском регионе, Приморском и Красноярском краях, в республике Алтай, в Якутии, на архипелаге Новая Земля, полуострова Крым и в Ямало-Ненецком АО, позволившие значительно расширить географический охват проводимого исследования. Всего 103 пробы.
Проведено выделение материала из проб с использованием метода промывки пробы через два сита. Собранный материал был подразделен разделялся на три основные части - для исследования методами световой и сканирующей электронной микроскопии и для получения молекулярно-генетических данных. Для исследования методами высокоразрешающей световой микроскопии изготавливали постоянные препараты в жидкости Хойера.
Образцы, отобранные для сканирующей электронной микроскопии расправлялись и фиксировались, затем проводились по ряду спиртов, высушивались методом критической точки и монтировались на столики. Смонтированный материал исследовался на сканирующем электронном микроскопе Tescan MIRA 3 LMU. Проведено выделение ДНК методами, обеспечивающими сохранение кутикулы тихоходок и изготовление «ваучерных» препаратов для образцов ДНК. Для изучения особенностей строения кутикулы, имеющих таксономическое значение ряд видов тихоходок были исследованы методом трансмиссионной этектронной микроскопии.
Для значительного числа особей секвенированы последовательности генетических маркеров. В первую очередь производилось секвенирование митохондриального баркода – гена COI. Этот маркер позволяет с высокой точностью определить принадлежность обнаруженных особей к уже описанным видам (в случае, если данные последовательности для них уже опубликованы). В случае отсутствия совпадения полученных нами последовательностей с известными для обнаруженного вида проводился углубленный морфологический и морфометрический анализ, для выявления его возможной идентичности с уже описанным видом, для которого отсутствуют молекулярно-генетические данные. В случае, если последовательность гена COI получить не удавалось или результат указывал на обнаружение нового вида или вида, ранее описанного исключительно морфологически, проводилось дополнительное секвенирование ядерного баркода ITS-2 или ITS-1. Также секвенировались фрагменты генов 18S и 28S рРНК.
Для проведения сравнительного молекулярно-генетического анализа были сформированы выравнивания для всех четырех используемых в работе маркеров, включающие полные регулярно обновляемые наборы данных из базы данных GenBank и все полученные нами последовательности. Для каждого полученного сиквенса проводилось его сравнение с опубликованными в GenBank данными, а так же с полученными нами неопубликованными данными, для выявления повторных обнаружений неописанных видов. Для всех новых последовательностей проводилась оценка их близости к уже известным при помощи вычисления параметра uncorrected p-distance.
Всего обработано 37 проб. В результате обработки создана коллекция постоянных препаратов тихоходок, в том числе включающая ваучерные экземпляы для проб ДНК (более 1500 препаратов, на которых находится более 3000 экземпляров тихоходок и отложенных яиц). Более 100 экземпляров тихоходок подготовлено для изучения на сканирующем электронном микроскопе.
Создана коллекция проб ДНК обнаруженных видов тихоходок (175 экземпляров, относящихся к 66 видам). Для каждой пробы ДНК сохранены кутикулярные части в качестве ваучерного экземпляра).
В ходе исследования обнаружено 82 вида тихоходок из них 40 (49%) – новые для науки, а 8 (10%) – новые для фауны России. Всего 16 видов (19,5%) были ранее указаны для территории Росссии. Для 5 из них мы впервые подтвердили морфологическую идентификацию методом сравнения полученных ДНК-баркодов с имеющимися в базе данных GenBank. Еще для 6 видов впервые получены молекулярно-генетические данные, что позволило уточнить их филогенетическое положение и (в ряде случаев) приведет к пересмотру их таксономического статуса.
Описан новый вид тихоходок рода Adropion c полуострова Камчатка.
Полученные в ходе работы данные по новому виду рода Meplitumen позволили установить его филогенетическое положение и показать, что этот род является младшим синонимом рода Platicrista.
Подготовлена к публикации статья с описанием двух видов рода Mesobiotus из Ленинградской области и Приморского края. С использованием полученных данных построена новая мультигеномная филогения рода Mesobiotus и проведен филогеографический анализ, подтвердивший существование нескольких хорошо обособленных комплексов видов – антарктического, двух тропических и голарктического.
В пробе с северного острова архипелага Новая Земля обнаружен новый вид рода Testechiniscus. Впервые для представитетеля этого редкого рода получен полный набор молекулярно-генетических данных. Также получены морфологические данные с использованием методов световой и сканирующей электронной микроскопии. Морфологический анализ позволил выявить ряд признаков, новых не только для рода Testechiniscus, но и для представителей семейства Echiniscidae. Их детальное описание позволит уточнить морфологический диагноз рода и расширит представления о морфологии панцирных тихоходок в целом.
Впервые получены молекулярно-генетические данные по видам Paramacrobiotus lorenae, Murrayon hastatus и Grevenius annulatus.
Paramacrobiotus lorenae – вид известный исключительно с Дальнего Востока России и из Китая. Полученные нами молекулярно-генетические данные позволили уточнить положение этого вида в составе рода Paramacrobiotus.
Murrayon hastatus – один из «старых» видов, таксономическое положение которого оставалось неясным до самого последнего времени. Это было связано с противоречивыми результатами анализа морфологии взрослых особей этого рода и отложенных яиц. Нами были обнаружены две популяции этого вида. Кроме того нами были получены данные по двум новым видам относящимся к родам Murrayon и Paramurrayon. Полученные молекулярно-генетические и морфологические данные позволили уточнить филогенетическое положение вида Murrayon hastatus.
Grevenius annulatus – также «старый» редкий вид, распространение которго приурочено к субарктическим и горным регионам. Нами получен и обработан обширный материал, включающий светооптические данные, данные сканирующей электронной микроскопии и полный набор молекулярно-генетических данных, позволившие подготовить интегративное переописание этого вида и пересмотреть его филогенетическое положение. Полученные нами данные свидетельствуют об обособленном положении этого вида в составе семейства Isohypsibiidae. Нами будет предложено и обосновано выделение этого вида в самостоятельный род. При исследовании этого вида нами были выявлены уникальные особенности строения кутикулы, ранее не встречавшиеся в пределах надсемейства Isohypsibioidea.
В результате проведенного исследования выявлено значительное разнообразие видов-двойников род Notahypsibius. Нами были исследованы представители этого рода из ряда локаций на территории России, а в качестве сравнительного материала были исследованы обнаруженные нами популяции видов рода из Австрии, Норвегии, Гренландии и со Шпицбергена. Полученное на основе анализа гена COI филогенетическое дерево рода Notahypsibius свидетельствует о существовании в пределах рода как минимум пяти видов-близнецов. Три из них обнаружены на территории России.
Выявлено значительное генетическое разнообразие в пределах комплексов морфологических видов Diphascon pingue, Dianea sattleri и Astatumen trinacriae. Обнаруженные нами популяции демонстрируют уровень различий, характерный для межвидового уровня, однако описание новых видов в пределах этих копплексов в настоящее время затруднено, поскольку для типовых видов этих родов нет опубликованных молекулярно-генетических данных и детальных переописаний.
Публикации
1. Туманов Д.В, Цветкова А.Ю. Some have drops and some do not, but can we rely on that? Re-investigation of Diphascon tenue (Tardigrada: Eutardigrada) with discussion of the phylogeny and taxonomy of the superfamily Hypsibioidea Zoosystematica Rossica, том 32, выпуск 1, стр. 50-74 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.31610/zsr/2023.32.1.50
2. Туманов Д.В., Калимуллин А.А. Adropion kamchaticum, a new species of Tardigrada (Eutardigrada, Hypsibiidae) from Russian Far East Zoosystematica Rossica, - (год публикации - 2024)