КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-24-00463

НазваниеИсследование структуры гетеродимерного комплекса сериновой протеазы вируса Денге методами магнитного резонанса

РуководительШернюков Андрей Владимирович, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ 2023 г. - 2024 г. 

Конкурс№78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словавирус Денге, сериновая протеаза, неструктурные белки NS2B и NS3, ЭПР спектроскопия

Код ГРНТИ34.17.00

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Тяжелая лихорадка Денге является основной причиной серьезных заболеваний и смерти в странах Азии и Латинской Америки. В настоящее время около половины населения мира находится в группе риска. На текущий момент специфического лечения лихорадки Денге/тяжелой формы Денге не существует. Необходимость участия в размножении вируса Денге в клетке собственной протеазы делает ее привлекательной мишенью для предотвращения инфекции. Для эффективного катализа сериновой протеазе вируса Денге необходим белковый кофактор, образующий с ней гетеродимерный комплекс, при этом детали их взаимодействия на структурном уровне до конца не установлены. Кроме того, во всех структурных исследованиях используют урезанный гидрофильный домен неструктурного белка NS2B (кофактор), при этом остаются не ясными вопросы о том как вырезанные трансмембранных домены влияют на структуру и динамику гидрофильного домена NS2B в гетеродимерном протеазном комплексе NS2B-NS3pro. Решение этих проблем может привести не только к улучшению нашего понимания природы катализа сериновых протеаз флавивирусов, но и к созданию более лучших, в том числе аллостерических, ингибиторов протеазы, которые можно будет использовать в качестве эффективных лекарственных средств в лечение лихорадки Денге. Цель проекта – решение актуальных задач в области изучения структуры и динамики сериновой протеазы вируса Денге методами импульсной ЭПР спектроскопии. Проект посвящен изучению сложных биологических систем методами магнитного резонанса. Для достижения цели проекта - исследования структуры и динамики сериновой протеазы вируса Денге, будет применены методы импульсной ЭПР спектроскопии, обладающий несколькими существенными преимуществами для изучения больших белковых молекул и их комплексов. Так, метод дипольного ЭПР позволяет измерить большие (по сравнению с ЯМР) расстояния внутри биомолекул (до 8 нм) и, в применении к протеазе Денге, позволит получить информацию об организации гетеродимерного протеазного комплекса. Научная новизна планируемых исследований: - Метод импульсной дипольной ЭПР спектроскопии будет впервые применен к исследованию гетеродимерного комплекса NS2B-NS3pro протеазы вируса Денге. - Будет впервые исследован протеазный комплекс с полноразмерным белком NS2B в присутствии мембраномиметика. Это позволит сделать вывод о влиянии трансмембраных доменов и близости к мембране на строение гетеродимерного протеазного комплекса вируса Денге.

Ожидаемые результаты
Следует ожидать, что все запланированные результаты будут получены на самом высоком научном уровне, поскольку все поставленные задачи являются актуальными, а уровень публикаций коллектива - высоким. Метод импульсной дипольной ЭПР спектроскопии будет впервые применен к исследованию гетеродимерного комплекса NS2B-NS3pro протеазы вируса Денге, в том числе с полноразмерным белком NS2B. В результате будет получена информацию об организации гетеродимерного протеазного комплекса в растворе и влиянии трансмембранных доменов на структуру и динамику гидрофильного домена NS2B в гетеродимерном протеазном комплексе NS2B-NS3pro. Полученная структурноя информация улучшит понимание природы катализа сериновых протеаз флавивирусов, и может быть использована в процессе создания эффективных, в том числе аллостерических, ингибиторов протеазы, которые можно будет использовать в качестве эффективных лекарственных средств в лечение лихорадки Денге.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках проекта был создан начальный “сетап” для наработки самих белков и необходимых одноцистеиновых мутантов, и сборки достаточно сложного конструкта гетеродимерного несвязанного линкером комплекса NS2B-NS3pro протеазы вируса Денге второго типа. Для получения комбинаторной библиотеки состоящей из разных одноцистеиновых мутантов использовали плазмиды белкового кофактора NS2B вируса Денге второго типа и мутантного белка NS3pro, содержащего в каталитическом фрагменте замену S135A, не влияющую на структуру гетеродимерного комплекса, но предотвращающего его протолитическую активность. Мутация S135A убирает нежелательный процесс самодеградации протеазного комплека, что позволяет изучать такие системы необходимое продолжительное время. Для получения мутантных форм был сконструирован и синтезирован набор олигонуклеотидных праймеров, удовлетворяющих условиям протокола проведения сайт-направленного мутагенеза. Были получены и подтверждены секвенированием 16 экспрессионных конструкций, содержащие запланированные мутации. Полученный набор будет использован в дальнейшей работе по направленному введению спиновых меток и изучения всех комбинаторных вариантов методом импульсного ЭПР. Для получения данных методом импульсной спектроскопии ЭПР необходимо использовать специальные спиновые метки, достаточно стабильные и обладающие подходящими параметрами для этого метода. В рамках текущего проекта на теоретическом квантово-химическом уровне был рассмотрен механизм гибели одного из типов таких меток, а именно водорастворимых триарилметильных радикалов, содержащих карбоксильные группы (производные финского тритила и OX063), протекающий в тиол-содержащих средах за счет взаимодействия с супероксид анион-радикалом. Были рассмотрены различные варианты взаимодействия водорастворимого радикала и супероксид-анион радикала отличающиеся степенью протонирования, а именно взаимодействие двух анионов, аниона радикала и нейтрального протонированного супероксида, нейтрального радикала и аниона супероксида. Найдены соответствующие пути реакции, и получены энергетические характеристики процессов. Таким образом было показано, что реакция гибели радикальной метки протекает гораздо более эффективно между анионом водорастворимого тритильного радикала и протонированной формой супероксид радикала.

 

Публикации