Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Артрогрипоз является одной из наиболее тяжёлых патологий среди врождённых пороков развития опорно-двигательного аппарата. Этиология заболевания до сегодняшнего дня остается неясной, и схема лечения определяется на основе клинических данных. Поэтому более глубокое понимание механизмов патологии, а также открытие ранее неизвестных клеточных и молекулярных мишеней необходимо, как для улучшения диагностики заболевания, так и для поиска новых эффективных методов его лечения. В проекте мы сконцентрировали внимание на поиске молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе развития врожденного множественного артрогрипоза (ВМА), а также редкого врожденного аутосомно-рецессивного заболевания - Синдрома Брука (СБ). Выявление возможных биомаркеров заболеваний и оценка генетического контроля процессов, нарушение которых ведет к развитию патологии, возможны при использовании, в том числе, транскриптомного анализа. Для его проведения, а также для других исследований в рамках проекта сформирована коллекция, насчитывающая на сегодняшний день 70 биоптатов пациентов с такими диагнозами как ВМА, ДА, а также иными патологиями, не связанными с мышцами. Весь материал предоставлен ФГБУ «Научно-исследовательский детский ортопедический институт имени Г.И. Турнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации. 50% коллекции составляют образцы мышечной ткани пациентов с диагнозом амиоплазия или ВМА, поскольку именно для данной группы пациентов, как правило, показано оперативное лечение, вызванное тяжестью течения данной патологии. Из собранной коллекции на основании клинического диагноза и с учетом области забора биоптата, была сформирована группа интереса для транскриптомного анализа, включившая в себя 20 образцов, из которых к настоящему моменту выделена тотальная РНК. В группу интереса вошли 12 образцов от пациентов с диагнозом ВМА и 8 - от пациентов, составляющих условный контроль. Для двух пациентов с амиоплазией и двух из группы условного контроля транскриптомный анализ с последующей бинформатической обработкой проведен в двух повторностях. В ходе первичного биоинформатического анализа этих образцов было выявлено 939 дифференциально экспрессирующихся гена (ДЭГ). У 338 генов экспрессия была понижена, у 601 гена повышена. GO анализ выявил 30 кластеров для ДЭГ с повышенной экспрессией и 3 кластера для ДЭГ с пониженной экспрессией. Помимо транскриптомного анализа образцов из коллекции, было проведено полноэкзомное секвенирование геномной ДНК двух детей с диагнозом дистальный артрогрипоз (ДА2B) и членов их семей, а также ДНК пациента с диагнозом СБ с целью поиска патогенных генетических вариантов. В результате с помощью биоинформатической обработки данных у пациентов с диагнозом ДА2B были обнаружены однонуклеотидные замены в гене TNNT3 (rs121434638 и rs199474721), которые приводят к изменению аминокислоты аргинин в положении 63, что подчеркивает ее критическую роль. При полноэкзомном секвенировании ДНК пациента с диагнозом СБ в гене PLOD2 были обнаружены однонуклеотидные замены rs778254905 и rs121434461. Выявленные мутации находятся в компаунд-гетерозиготном состоянии. Методом секвенирования по Сэнгеру у четырех пациентов из семьи, где двоим детям был поставлен диагноз СБ обнаружена мутация rs1378540661 в гене PLOD2. У больных детей мутация находится в гомозиготном состоянии, а у здоровых родителей - в гетерозиготном. У ребенка из другой семьи были выявлены однонуклеотидные замены rs387906960 и rs782815501 в компаунд- гетерозиготном состоянии гена FKBP10. У одного из родителей пациента обнаружена мутация rs782815501 в гетерозиготном состоянии, образец ДНК второго родителя отсутствовал. Еще одно направление нашего проекта - поиск механизмов патогенеза СБ, малоизученного заболевания, характеризующегося повышенной ломкостью костей и прогрессирующими контрактурами суставов, сходными с таковыми при артрогрипозе. В настоящее время показано, что с СБ ассоциированы мутации в генах FKBP10 и PLOD2. Данные гены кодируют резидентные белки эндоплазматического ретикулума, которые играют важную роль в биосинтезе коллагена I типа, что, в свою очередь, влияет на структуру и прочность соединительных тканей и костей в организме. Мутации связаны с нарушениями как первичной цепи коллагена, так и его посттрансляционного формирования. Определение механизма, с помощью которого мутации приводят к фенотипам СБ, затруднено в том числе из-за отсутствия моделей заболевания. В связи с этим, одной из задач нашего проекта было создание генетических конструкций с мутациями в гене PLOD2 для анализа их патогенности на культурах клеток. В литературе описаны как патогенные и ассоциированные с развитием СБ мутации THR629Ile (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/RCV000008080/) и Thr629Ala в гене PLOD2. В рамках первого года реализации проекта нами были получены генетические конструкции pJ016 и pJ017 для экспрессии мутантных аллелей гена PLOD2 (Thr629Ala и Thr629Ile). В качестве контроля была получена генетическая конструкция pJ014 для экспрессии гена PLOD2 дикого типа. Для определения локализации продукта гена PLOD2 созданы генетичекие конструкции для экспрессии двух мутантных и нативного вариантов PLOD2 белка, содержащих ген зеленого флуоресцентного белка GFP (pJ020, pJ021 и pJ022). Данные конструкции трансфицированы в клетки HEK293 и FD2. Эффективность трансфекции определяли по включению в клетки GFP.