Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Использование ионизирующего излучения является перспективным подходом в терапии опухолей. Важной задачей является обеспечение эффективного поглощения ионизирующего излучения в зоне опухоли с целью снижения его токсического действия на окружающие здоровые ткани. Повышение эффективности воздействия облучения на опухолевую ткань может обеспечить использование локализованных в ней радиосенсибилизаторов. Задачей данного проекта является оценка потенциала радиосенсибилизации наночастиц на основе оксида железа Fe3O4, покрытых органической оболочкой (декстрановой или цитратной) для их стабилизациии и предотвращения слипания, а также для предотвращения их прямого токсического воздействия на жизненно важные органеллы клетки. На первом этапе выполнения проекта для наночастиц была выбрана декстрановая оболочка. Была отработана и оптимизирована методика синтеза Fe3O4 наночастиц в декстрановой оболочке. В частности, были оптимизированы скорость подачи осадителя и время ультразвуковой обработки суспензии при покрытии наночастиц декстраном. Продолжительность ультразвуковой обработки в большой степени определяет качество покрытия наночастиц и как следствие коллоидную устойчивость полученных МНЧ. В результате оптимизации методики синтеза была обеспечена возможность получения в каждом синтезе наночастиц с воспроизводимыми параметрами. Синтезированные наночастицы на основе оксила железа в декстрановой оболочке были охарактеризованы с использованием: (i) рентгеновской дифракции; (ii) просвечивающей электронной микроскопии; (iii) динамического светорассеяния; (iv) продольного нелинейного отклика на слабое переменное магнитное поле. Рентгеновская дифракция свидетельствовала о Fe3O4 ядре наночастиц с областью кристалличности 9(1) нм и об отсутствии примесных фаз других окислов железа. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) показала образование наночастицами в декстрановой оболочке (гранулы диаметром ~ 10 нм) агрегатов с логнормальным распределением по размерам и средним диаметром 45(8) нм. Контраст на микрофотографиях обеспечивался ядрами магнетита, тогда как оболочки декстрана вокруг ядер были лишь слегка заметны в виде тонких промежутков (~ 1.5 нм) между темными пятнами. Средний диаметр Fe3O4 ядер наночастиц в пределах точности измерений был равен рентгеноструктурному размеру кристалличности. Таким образом, в магнетитной фракции наночастиц некристаллическая фаза не обнаружена. Динамическое светорассеяние (ДСР) подтвердило присутствие агрегатов наночастиц в водном коллоидном растворе, их средний гидродинамический диаметр равнялся 66(10) нм. Больший средний размер агрегатов по сравнению с результатами ПЭМ связан с увлечением прилегающего слоя воды при броуновском движении агрегатов в водной суспензии. Данные продольного нелинейного отклика, полученные для водной суспензии МНЧ после их обработки с применением формализма, базирующегося на стохастическом уравнении Гильберта-Ландау-Лифшица сводящегося к уравнению Фоккера-Планка для наночастиц в суперпарамагнитном режиме, подтвердили образование агрегатов МНЧ в водной суспензии. Образование агрегатов приводит к существенному уменьшению магнитного момента агрегата по сравнению с суммой моментов, входящих в него МНЧ, вследствие дипольных корреляций и, соответственно, к уменьшению магнитостатической энергии ансамбля МНЧ в растворе, и, в конечном счете, его свободной энергии. Дисперсия магнитных моментов агрегатов описывалась логнормальным распределением со средним значением 61100(270) µB в водной суспензии и 35170(180) µB в среде для культивации клеток. Ширина распределения магнитного момента агрегатов, являющихся магнитными центрами составляла: 2.12(2) для водной суспензии и 0.68(1) для среды. Была определена средняя магнитная анизотропия магнитных центров: 260(25) K для водной суспензии и 11.3(2) K для среды. Были найдены также динамические параметры агрегатов: коэффициент затухания α равнялся 0.228(1) для водной суспензии и 0.163(1) для среды; время Неелевской релаксации составляло 1.81(1) нс для водной суспензии и 1.41(1) нс для среды. Степень агрегации, т.е. среднее число МНЧ в агрегатах в дистиллированной воде составляло 55, а в среде для культивирования – 11 наночастиц. Такая кластеризация была примерно одинакова для всех проб в соответствующих растворителях. 2) Были получены данные о накоплении магнитных наночастиц оксида железа в декстрановой оболочке в клетках злокачественной глиомы A-172 и клетках нормальной морфологии ФЛЭЧ (фибробласты эмбриона легкого человека). На основании этих данных был выбран протокол инкубации опухолевых клеток с наночастицами перед облучением. Исследование инкорпорации наночастиц в опухолевые клетки методом нелинейного магнитного отклика на слабое переменное магнитное поле позволила оценить накопление МНЧ в клетках и оптимальное время совместной инкубации (24 часа), а также предпочтительную плотность начального посева (~ 2·10^4 клеток/лунку).. 3) Были получены данные о потенциале магнитных наночастиц оксида железа с декстрановым покрытием в качестве сенсибилизаторов при воздействии на клетки глиом рентгеновского излучения, гамма-радиации, а также облучения протонами на пике Брэгга. (i) Рентгеновское излучение. Проверка радиосенсибилизирующего эффекта наночастиц на клеточных моделях А-172 и Gl-Tr при воздействии рентгеновского излучения показала, что жизнеспособность обеих клеточных линий, протестированных двумя методами (резазурин-тест и метод окрашивания кристаллическим фиолетовым), снижается при совместном использовании рентгеновского облучения и наночастиц, демонстрируя статистически значимое отличие от контроля. Эта разница наблюдалась при каждой дозе облучения в диапазоне 1–6 Гр. Таким образом, оба теста на жизнеспособность подтверждают появление комбинированного эффекта при рентгеновском облучении клеток, содержащих наночастицы. (ii) Гамма-излучение. После гамма-облучения клеток при помощи резазурин-теста выявлена статистически значимая разница между жизнеспособностью клеток, облученных после культивирования без и с наночастицами при каждой дозе облучения в диапазоне 2–6 Гр для линии клеток Gl-Tr и только при дозе 2 Гр для клеток А-172. Данные о жизнеспособности клеток, полученные путем окрашивания кристаллическим фиолетовым после воздействия на клетки гамма-облучения, демонстрировали качественные различия в количестве выживших клеток, культивируемых без/с МНЧ, что соответствует результатам резазурин-теста. Однако они не являются статистически значимыми из-за большей ошибки. В целом, суммируя результаты обоих тестов, сенсибилизирующий эффект МНЧ в сочетании с гамма-облучением не является универсальным и, вероятно, зависит от клеточной линии. (iii) Протонное облучение. При облучении протонным пучком на пике Брэгга не наблюдалось статистически значимой разницы в жизнеспособности клеточных линий А-172 и Gl-Tr, культивируемых в присутствии наночастиц и без них. Это указывает на недостаточное образование как вторичных электронов, так и активных форм кислорода (АФК) в облученных клетках. Возможно, на пике Брэгга потерявшие энергию протоны захватывают выбитые ими вторичные электроны с образованием атомов водорода. Поэтому количество вторичных электронов генерируемых протонами, вероятно, значительно уменьшается, что сопровождается уменьшением наносимого ими ущерба. По-видимому, не происходит также существенного повреждения декстрановой оболочки МНЧ и увеличения генерации АФК. Большая часть полученных результатов представлена в опубликованной статье: Tran, N.H.; Ryzhov, V.; Volnitskiy, A.; Amerkanov, D.; Pack, F.; Golubev, A.M.; Arutyunyan, A.; Spitsyna, A.; Burdakov, V.; Lebedev, D.; Konevega, A.; Shtam, T.; Marchenko, Y. Radiosensitizing Effect of Dextran-Coated Iron Oxide Nanoparticles on Malignant Glioma Cells. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24(20), 15150. https://doi.org/10.3390/ijms242015150