КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-25-10043

НазваниеВклад нейтрофильных внеклеточных ловушек в патогенез и прогноз первичной туберкулезной инфекции у детей на материалах региона с сохраняющейся заболеваемостью детским туберкулезом (Омская область)

РуководительМордык Анна Владимировна, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Омский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Омская обл

Период выполнения при поддержке РНФ 2023 г. - 2024 г. 

Конкурс№76 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» (региональный конкурс).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-231 - Инфекционные заболевания

Ключевые словапервичный туберкулез, нейтрофильные внеклеточные ловушки, туберкулез у детей, инфицирование МБТ, патогенез туберкулеза, функциональная активность нейтрофилов

Код ГРНТИ76.29.53

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Ведущую роль в патогенезе первичного туберкулеза отводят снижению иммуно-биологической резистентности. Одним из относительно недавно открытых звеньев первичного иммунного ответа является процесс образования нейтрофилами внеклеточных ловушек – нетоз. Его развитие имеет неоднозначные эффекты: с одной стороны, нетоз является важным элементом врожденного иммунитета, а с другой стороны, может рассматриваться как один из ведущих патогенетических факторов прогрессирования ряда заболеваний, в том числе и органов дыхания. Научная новизна данного исследования заключается в том, что комплексное исследование роли нетоза в развитии первичного туберкулеза у детей будет выполнено впервые. В исследовании примут участие дети, инфицированные микобактерией туберкулеза (МБТ), но не имеющие рентгенологических проявлений заболевания, и дети, у которых сформировался активный туберкулез, очаги Гона и кальцинаты во внутригрудных лимфатических узлах. Во всех группах в крови будет определён маркер состоявшегося нетоза (цитруллинированный гистон H3) и оценена реактивность нейтрофилов по отношению к стимулятору нетоза in vitro по методике, запатентованной авторским коллективом в 2022 году. Количественное соотношение и структура формирующихся in vitro внеклеточных сетей ДНК (облаковидных и нитевидных), а также процентное отношение клеток, находящихся в разной степени активации, будут оценены методом флуоресцентной микроскопии. На первом этапе будет проведен сбор анамнестических, клинических и лабораторных данных, результатов лучевых исследований, оценен нетозформирующий потенциал нейтрофилов и собрана коллекция образцов плазмы для ИФА-исследования при латентной туберкулезной инфекции и туберкулезе у детей. После сбора необходимого количества образцов плазмы будет проведено одномоментное ИФА-исследование. Все полученные данные будут внесены в базу данных для статистической обработки. На втором этапе будут сопоставлены и проанализированы полученные данные в соответствии с динамикой течения заболевания у детей с первичным туберкулёзом, оценены особенности реакций образования внеклеточных ловушек нейтрофилов при различном течении и исходах заболевания. Результаты исследования роли образования внеклеточных ловушек нейтрофилов при различных вариантах течения первичной туберкулезной инфекции у детей расширят современные научные представления о патогенезе первичного туберкулеза, позволят совершенствовать профилактику туберкулеза на этапе предотвращения перехода инфицирования МБТ в заболевание, позволят прогнозировать течение первичной туберкулезной инфекции, повысить эффективность ее лечения у детей, в том числе, с помощью обоснованного патогенетического воздействия. Появится возможность оценить риски развития прогрессирования и осложненного течения процесса при первичном туберкулезе у детей. Будет создан научный базис для разработки индивидуального подхода при оказании медицинской помощи детям с первичным туберкулезом, что будет способствовать снижению возможного числа осложнений туберкулезного процесса, непереносимости лекарственной терапии и уменьшению длительности пребывания ребенка в стационаре. В процессе раелизации проекта планируется разработать и изготовить экспериментальный образец собственной импортозамещающей тест-системы, позволяющей определить в крови маркеры нетоза у пациентов с туберкулезом и/или тест-системы для оценки нетозформирующей активности изолированных нейтрофилов пациентов с туберкулёзом.

Ожидаемые результаты
Научная и практическая значимость реализации проекта: 1) Расширение современных научных представлений о патогенезе первичного туберкулеза. Впервые будет оценена роль образования внеклеточных ловушек нейтрофилов на различных этапах течения первичной туберкулезной инфекции у детей, включая латентную туберкулезную инфекцию, активный туберкулез органов дыхания и самостоятельное формирование посттуберкулезных изменений. Полученные данные позволят в перспективе разработать новые патогенетические подходы в профилактике туберкулеза на этапе перехода инфицирования Micobacterium tuberculosis в заболевание. 2) Исследование роли нетоза в динамике течения первичной туберкулезной инфекции и активного туберкулеза в процессе проведения химиотерапии (в ряде случаев превентивной) позволит прогнозировать течение первичной туберкулезной инфекции, как латентной, так и заболевания, и в дальнейшем, повысить эффективность его лечения с помощью обоснованного патогенетического воздействия. 3) Оценка применимости нетоза как потенциально нового лабораторного маркера во фтизиатрии, позволяющего оценить риски развития прогрессирования и осложненного течения процессса при первичном туберкулезе у детей. 4) Создание алгоритма для прогнозирования эффективности лечения первичного туберкулеза у детей с включением показателей нетоза позволит разработать индивидуальный подход для оказания медицинской помощи детям с первичным туберкулезом, снизить возможное число осложнений туберкулезного процесса, уменьшить длительность пребывания ребенка в стационаре. 5) Разработка и изготовление экспериментального образца собственной импортозамещающей тест-системы, позволяющей определить в крови маркеры нетоза у пациентов с туберкулезом и/или тест-системы для оценки нетозформирующей активности изолированных нейтрофилов пациентов с туберкулёзом.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Работа по проекту в отчётный период была направлена на формирование репрезентативной выборки детей на этапе включения методом поперечного среза. Всего в исследование вошло 217 детей, которые были распределены по пяти основным исследовательским группам. В первую группу вошли 70 детей без признаков сенсибилизации к антигенам Mycobacterium tuberculosis, возраст детей от 4 до 7 лет. Во вторую группу были включены 57 детей с впервые выявленным положительным результатом пробы с аллергеном туберкулезным (АТ, туберкулином), пробы Манту с 2 ТЕ, но отрицательным результатом пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным (АТР, Диаскинтест), возраст детей от 4 до 7 лет. Третья исследовательская группа - это 56 детей с положительными результатами кожных иммунологических тестов (с АТ и АТР), но без лучевых признаков туберкулеза по результатам мультиспиральной компьютерной томографии органов грудной клетки (МСКТ ОГК). Четвертая группа включала в себя 30 детей с положительными результатами кожных иммунологических тестов (с АТ, АТР) и активным туберкулезом органов дыхания. В пятую группу вошли 30 детей с положительными результатами кожных иммунологических тестов (с АТ, АТР) и выявленными по данным МСКТ ОГК посттуберкулезными изменениями (кальцинаты во внутригрудных лимфатических узлах, в легочной ткани, фиброзные очаги, плевральные наслоения). У всех вошедших в исследование детей (включенных в 1-ю – 5-ю исследовательские группы) в первой (исходной) исследовательской точке проведен сбор анамнестических, клинических и лабораторных данных, результатов лучевых исследований (для детей из 3, 4 и 5 исследовательских групп), оценена способность нейтрофилов ex vivo формировать внеклеточную ловушку, и собраны образцы сыворотки и плазмы для ИФА-исследований с целью определения концентрации цитруллинированного гистона Н3. У всех детей, вошедших в исследование в конце первого квартала и во втором квартале 2023 года (n=84), во второй исследовательской точке (6 мес) определена способность нейтрофилов к формированию внеклеточной ловушки и собраны образцы сыворотки крови. Нейтрофилы, выделенные из крови третьей и четвертой исследовательских групп, обладали более выраженным нетозобразующим потенциалом после действия стимулятора нетоза в сравнении с первой (контрольной группой). Нейтрофилы выделенные из крови детей первой и третьей групп формировали преимущественно нитевидные НВЛ. Доля нитевидных НВЛ в препарате третьей группы после действия стимулятора составила (Mе=27,8; Q1=21,8; Q3=34,9), что было статистически значимо выше (p=0,0297) контрольных значений (Mе=16,1; Q1=12,8; Q3=18,3). Нейтрофилы четвертой исследовательской группы (группа детей с туберкулёзом органов дыхания) формировали преимущественно и статистически значимо чаще в сравнении с первой группой (p=0,0007) облаковидные НВЛ, медиана доли этого типа ловушек в контрольной группе составила лишь 4,9%, а межквартильный размах – от 4,2% до 7,2%, в четвертой группе ‒ Mе=15,7% (Q1=11,1%; Q3=28,5%). Определены возрастные особенности способности нейтрофилов к формированию внеклеточных ловушек, которые характеризовались более выраженной реакцией нейтрофилов на стимулятор нетоза у детей в контрольной группе в сравнении с нейтрофилами, выделенными из крови в группе здоровых взрослых волонтёров – нейтрофилы детей интенсивнее, чем у взрослых, формировали нитевидные НВЛ. В группах больных туберкулезом легких детей и взрослых реакция нейтрофилов на стимулятор нетоза была диаметрально противоположной. Нейтрофилы детей с первичным туберкулёзным комплексом, как и в контрольной группе, преимущественно формировали нитевидные НВЛ, но в большем количестве, а нейтрофилы взрослых с инфильтративной или очаговой формой с объемом поражения 2 и менее сегментов в основном формировали облаковидные НВЛ. Проведено одномоментное ИФА-исследование на 160 образцах с целью определения концентрации цитруллинированного гистона Н3 в сыворотке крови детей из первой (n=35), второй (n=35), третьей (n=30), четвертой (n=30) и пятой исследовательских групп (n=30). При статистической обработке полученных результатов установлено, что у здоровых детей концентрация цитруллинированного гистона Н3 имеет минимальные значения в сравнении с другими группами. Медиана в контрольной группе составила 1,638 нг/мл, межквартильный размах (Q1-Q3) от 1,398 нг/мл до 1,950 нг/мл соответственно. Уровень цитруллинированного гистона Н3 у детей, больных туберкулезом (четвертая группа), статистически значимо (р=0,026) повышался Me=7,084 нг/мл (Q1=2,179 нг/мл; Q3=17,390 нг/мл) относительно контрольных значений. Максимальных значений концентрация цитруллинированного гистона Н3 достигала в группе детей пятой группы с остаточными посттуберкулезными проявлениями (Me=9,156 нг/мл; Q1=4,195 нг/мл; Q3=21,429 нг/мл), статистически значимо (р=0,013) отличаясь от контрольных значений. В рамках работ по разработке тест-системы проведен патентный поиск, оценены аналитические характеристики существующих коммерческих тест-систем. На основании результатов информационного поиска предложены два концепта для выявления измененной реактивности нейтрофилов при туберкулёзе. Первый концепт предполагает определение в крови или в культуре изолированных нейтрофилов после стимуляции одного из основных компонентов НВЛ – фермента нейтрофильной эластазы с измерением его активности (кинетическим методом) по отношению к специфическому субстрату для этого фермента (пепдид N-метилсукцинил-ала-ала-про-нитроанилид), а второй концепт предполагает определение в культуре изолированных нейтрофилов после стимуляции методом люминесцентной микроскопии процентного отношения НВЛ, зрелых нейтрофилов (CD45+ нейтрофилы) и нейтрофилов, склонных к быстрому формированию НВЛ (CD177+ нейтрофилы). Возможности предложенных концептов тест-систем планируется исследовать в 2024 году.

 

Публикации

1. Мордык А.В., Золотов А.Н., Новиков Д.Г., Романова М.А., Индутный А.В., Кириченко Н.А., Птухин А.О. Возрастные особенности формирования внеклеточных ловушек нейтрофилов у здоровых лиц и больных туберкулёзом Вестник современной клинической медицины, Том 16, вып. 6, С. 37-45 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.20969/VSKM.2023.16(6).37-45.

2. Мордык А.В., Золотов А.Н., Новиков Д.Г., Романова М.А., Кириченко Н.А., Птухин А.О. Нетозобразующая способность нейтрофилов у детей с латентной туберкулезной инфекцией при положительной пробе с аллергеном туберкулезным рекомбинантным ВОПРОСЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ ПЕДИАТРИИ, том 18, №5, с. 7–12 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.20953/1817-7646-2023-5-7-12

3. Новиков Дмитрий Георгиевич, Золотов Александр Николаевич, Мордык Анна Владимировна, Птухин Александр Олегович, Романова Мария Алексеевна, Индутный Антон Васильевич, Кириченко Николай Александрович Способность нейтрофилов периферической крови к формированию внеклеточной ловушки ex vivo у здоровых детей и детей больных туберкулезом -, - (год публикации - )

4. Романова Мария Алексеевна, Мордык Анна Владимировна, Новиков Дмитрий Георгиевич, Золотов Александр Николаевич, Птухин Александр Олегович Иммунодиагностические и рентгенологические характеристики у детей с туберкулезом органов дыхания и посттуберкулезными изменениями -, - (год публикации - )