КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 23-64-10007

НазваниеБиотехнологический синтез белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков с использованием в качестве нового углеродного субстрата жиросодержащих отходов технологий рыбопереработки: фундаментальное обоснование и реализация

РуководительВолова Татьяна Григорьевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук", Красноярский край

Период выполнения при поддержке РНФ 2023 г. - 2026 г. 

Конкурс№82 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (междисциплинарные проекты).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словабиотехнологический синтез, целевые продукты, белок одноклеточных, разрушаемые биопластики, субстраты, жиросодержащие отходы рыбопереработки, состав отходов, полнота утилизации, структура и свойства целевых продуктов, новые биотехнологии, Технические условия, Исходные данные, масштабирование,

Код ГРНТИ62.09.99

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Научная проблема, на решение которой направлен проект, заключается в фундаментальном обосновании, разработке и реализации технологий получения целевых биотехнологических продуктов (белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков) за счет использования отходов рыбопереработки в качестве нового источника углеродного сырья. Актуальность и значимость этой междисциплинарной научной проблемы обоснованы вызовами, которые включают дефицит социально значимых целевых продуктов, включая белок одноклеточных и разрушаемые экологически чистые материалы нового поколения на фоне нарастающих глобальных экологических проблем. Для решения проблемы, наряду с традиционными технологиями и средствами, все большее значение имеют технологии, препараты и материалы, получаемые в процессах биотехнологии. Однако масштабность и экономическая целесообразность биотехнологических процессов во многом определяется ресурсами доступных субстратов, что делает актуальным привлечение новых субстратов, включая отходы. Крупнотоннажным и возобновляемым ресурсом для получения субстратов биотехнологии в проекте рассматриваются жиросодержащие отходы пищевых технологий рыбопереработки. Малоизученность этого субстрата делает необходимым проведение фундаментальных исследований для повышения эффективности технологий рыбопереработки и использование отходов не только для получения рыбной муки, но более востребованных продуктов с высокой добавленной стоимостью. К таковым относятся белок одноклеточных и разрушаемые микробные пластики. Новизна проекта обусловлена неисследованной возможностью применения жиросодержащих отходов рыбопереработки в качестве нового углеродного субстрата биотехнологии для получения белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков. Заявленный инновационный и междисциплинарный проект аналогов не имеет и на сегодняшний день – вне конкуренции. Междисциплинарный проект направлен на фундаментальное обоснование, разработку и реализацию новых биотехнологий биосинтеза белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков за счет использования нового углеродного субстрата (отходов пищевой рыбопереработки), его реализация требует объединения знаний, потенциала, подходов, специалистов различных отраслей знаний: «04 Биология и науки о жизни» (04-209 Биотехнология (в том числе бионанотехнология)) и «06-Сельское хозяйство» (06-301 Технология пищевых продуктов). Заявитель проекта Институт биофизики СО РАН имеет компетенции и сильные научные заделы в области «белой» биотехнологии, относящиеся к отрасли: «04 Биология и науки о жизни» (04-209 Биотехнология (в том числе бионанотехнология)) в части разработки и исследования продуцирующих микробных биосистем, биотехнологического синтеза целевых продуктов, включая белок одноклеточных и разрушаемые биопластики полигидроксиалканоаты, и ориентирован на расширение сырьевой базы и поиск новых доступных субстратов. Для исследования жиросодержащих отходов рыбопереработки, отличающихся видовым разнообразием, высокой вариативностью химического состава и нестабильностью качества, как основы для разработки эффективных технологий их переработки, в качестве партнера в проекте участвует Калининградский государственный технический университет, один из ведущих университетов России в области исследований рыбных ресурсов и ориентированный на поиск новых областей применения отходов для получения новых ценных продуктов; его компетенции и научные результаты лежат в области: «06-Сельское хозяйство» (06-301 Технология пищевых продуктов). Объединение потенциала двух научных коллективов – Института биофизики СО РАН и Калининградского государственного технического университета будет использовано для выполнения заявляемого междисциплинарного проекта. Научные знания и компетенции, созданные заделы и сформировавшийся опыт сотрудничества в данных направлениях исследований обеспечат успешное решение всех сформулированных задач заявляемого междисциплинарного проекта.

Ожидаемые результаты
Выполнение проекта даст новые знания о процессах и технологиях переработки рыбного сырья, которые обеспечат получение нового доступного субстрата для новых процессов биосинтеза востребованных целевых продуктов (белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков), сократят количество неиспользуемых отходов рыбного сырья и повысят эффективность пищевых технологий рыбопереработки (схема выполнения проекта и планируемых к получению результатов даны в Приложении 2). Цели, задачи и результаты проекта соответствуют современным мировым вызовам и вытекающим из них трендам научных исследований, ориентированным на рациональное использование природных ресурсов, сокращение отходов техносферы, восполнение ресурсов пищи и востребованных материалов нового поколения в новых и эффективных технологиях с привлечением новых и доступных источников сырья, включая отходы. В Институте биофизики СО РАН (заявитель проекта) будут проведены пионерные исследования возможности и закономерностей биосинтеза белка одноклеточных и разрушаемых микробных биопластиков (полигидроксиалканоатов, ПГА) на жиросодержащих отходах рыбопереработки, полученных в КГТУ партнером проекта; разработаны и реализованы новые биотехнологии их получения. Скрининг коллекции микроорганизмов обеспечит отбор штаммов, высокоактивных по липолитической активности, способных к продуктивному росту на жиросодержащем субстрате из отходов рыбы в качестве единственного источника углерода; будет исследовано влияние типа и состава жирового субстрата на продукцию, состав белка и ПГА, полноту использования компонентов субстрата; для повышения полноты его использования будут оптимизированы методы эмульгирования жира с применением физических методов и химических реагентов. Наиболее продуктивные штаммы и процессы будут масштабированы до камерального уровня и исследованы в специализированных режимах: биосинтеза белка – в проточном режиме на полной среде при максимально возможной скорости разбавления, обеспечивающим максимальную белоксинтезирующую активность клеток; биосинтеза ПГА – в периодическом режиме при лимитировании роста клеток по азоту (фактор, стимулирующий суперпродукцию резервных ПГА); определены кинетические и продукционные показатели процессов; получены образцы целевых продуктов и исследованы полноценность и качество белка (общий выход, аминокислотный состав, СКОР, переваримость протеолитическими ферментами), а также химический состав (набор и соотношение мономеров), выходы и состав ПГА, влияние субстрата на свойства (молекулярно-массовые и температурные, степень кристалличности), перерабатываемость в специализированную пленочную продукцию. Будет оптимизирован затратный и сложный процесс экстракции ПГА из биомассы клеток, снижены затраты времени и реагентов, количество примесей в полимере. На основе анализа полученных результатов будут выбраны наиболее результативные технологии биосинтеза целевых продуктов на новом субстрате и масштабированы до уровня опытной реализации; определены сырьевые затраты, наработаны и охарактеризованы опытные партии целевых продуктов для последующего тестирования и демонстрации полученных результатов; выполнена технико-экономическая оценка стоимости продуктов биосинтеза; разработаны и зарегистрированы Технические условия на их получение; проведено патентование результатов, будут разработаны и зарегистрированы Исходные данные, необходимые для последующего масштабирования технологий и коммерциализации результатов проекта. В КГТУ (партнер проекта) впервые будет решена задача повышения эффективности пищевых технологий рыбопереработки вовлечением в процессы переработки ранее неиспользуемых отходов; впервые будут разработаны технологии получения из отходов субстратов, пригодных для биотехнологического получения белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков. Будут привлечены и исследованы наиболее крупные и богатые жиром, но малоперерабатываемые отходы (копченые головы кильки производства шпрот; скоропортящиеся внутренние органы судака, головы скумбрии атлантической), образуемые при разделке для последующего копчения, посола, заморозки и пр.); исследовано влияние различных способов (физических, химических и комбинированных методов) на полноту извлечения жира из отходов; исследовано влияние исходного биосырья, методов и параметров переработки на химический состав и качество жира. По результатам анализа исследованных процессов с использованием в качестве критериев отбора полноты извлечения жира и его качества будут отобраны наиболее результативные технологии извлечения жира из отходов, и будут наработаны партии жира, которые будут передаваться ИБФ СО РАН. По результатам исследования в ИБФ СО РАН и совместного анализа эффективности применения партий жиросодержащего сырья в процессах биотехнологии будут выбраны наиболее результативные; проведена оптимизация способов переработки отходов для максимизации полноты извлечения жира заданного химического состава, включая набор и соотношение жирных кислот, обеспечивающих максимизацию утилизации субстрата и трансформации в процессах микробного метаболизма в белок и/или ПГА. По мере масштабирования в ИБФ СО РАН биотехнологических процессов в КГТУ будут масштабированы процессы обработки рыбных отходов и наработаны укрупненные партии сырья, включая обеспечение технологий опытного (пилотного) уровня. Будут разработаны и зарегистрированы Технические условия на новые технологии рыбопереработки; выполнена технико-экономическая оценка стоимости жиросодержащего сырья из исследованных отходов, оценено влияние полученных результатов на повышение эффективности пищевых технологий рыбопереработки; проведено патентование результатов; разработаны Исходные данные для последующего масштабирования технологий и их коммерциализации. Объединение научных компетенций, знаний и научных заделов заявителя и партнера проекта позволяют заявлять данный междисциплинарный проект с высокой вероятностью достижения главной цели проекта и выполнения всего комплекса задач, относящихся к сфере двух различных отраслей знаний: «04 Биология и науки о жизни» (04-209 Биотехнология) и «06-Сельское хозяйство» (06-301 Технология пищевых продуктов). Общим результатом выполнения проекта станет комплексный междисциплинарный физико-химико-биотехнологический проект т.н. полного цикла, включающий в качестве объекта исследования рыбное сырье, используемое в пищевых технологиях рыбоперерабатывающей отрасли, включая образующиеся отходы, микробные штаммы продуценты и не имеющие аналогов разработанные биотехнологические процессы биосинтеза белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков (Блок-схема комплексной технологии дана в Приложении 2). Объединение компетенций и потенциала двух коллективов (ИБФ СО РАН и КГТУ) обеспечит разработку и реализацию новых биотехнологий восполнения ресурсов белка и разрушаемых биопластиков на новом, доступном и воспроизводимом природном сырьевом ресурсе и технологий рыбопереработки, снижающих количество неутилизируемых отходов и повышающих эффективность рыбоперерабатывающей отрасли. Новые фундаментальные знания и важные результаты, полученные в ходе совместного выполнения междисциплинарного проекта коллективами КГТУ и ИБФ СО РАН, составят научную основу и обеспечат разработку новых и эффективных технологий, реализованных на уровне опытных производств и готовых для практической реализации: - исследованные и разработанные процессы переработки ранее неиспользуемых отходов рыбного сырья обеспечат получение нового и доступного углеродного субстрата для биотехнологии, повысят эффективность пищевых технологий рыбопереработки и использования биоресурсов рыбной отрасли, сократят количество неутилизируемых отходов; - технология получения белка одноклеточных на новом субстрате из отходов рыбопереработки заложит основы для создания отечественной биотехнологии получения важнейшего компонента (белка) для кормопроизводства, предназначенного для с/х животных и аквакультуры, это обеспечит вклад в повышение продовольственной безопасности страны; - экспериментально доказанная возможность синтеза разрушаемых биопластиков на доступном субстрате, получаемом из отходов, и разработанная технология биосинтеза внесут вклад в решение глобальной проблемы замены синтетических пластиков; новые знания и возможность получения ПГА за счет отходов направлены на расширение областей их применения, включая в перспективе производство разрушаемых средств лова для рыболовства, устройств для аквакультуры, разрушаемую упаковку рыбы и рыбных продуктов; - результаты междисциплинарного проекта, совместно полученные ИБФ СО РАН и КГТУ, защищенные охранными документами, разработанные и зарегистрированные в органах стандартизации РФ Технические условия на новые технологии рыбопереработки, биосинтеза белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков, разработанные Исходные данные составят необходимую основу для последующего этапа масштабирования технологий и коммерциализации на предприятиях реального сектора экономики РФ.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
План НИР 2023 года выполнен, получены следующие основные результаты: На основе современных источников подготовлен и издан научный обзор «Жиросодержащие отходы технологий рыбопереработки – объемы, состав, области применения» / О. Я. Мезенова, С. В. Агафонова, Н. Ю. Романенко, В. В. Волков, Н. С. Калинина. – Калининград: Изд-во ФГБОУ ВО «КГТУ», 2023. –182 с. ISBN 978-5-94826-675-6. Впервые для получения жиросодержащего сырья в качестве биотехнологического С-субстрата на основе анализа крупнотоннажных отходов, образуемых на рыбоконсервных предприятиях Калининградской области, выбраны и исследованы три вида отходов: головы копченой балтийской кильки (отходы производства консервов «Шпроты в масле»), головы атлантической скумбрии (отходы производства консервов «Скумбрия натуральная в масле»), внутренности судака балтийского (отходы производства филе и фарша). Исследованы и оптимизированы параметры термического способа извлечения жира из отходов по показателям: выход жира и его качество при варьировании температуры, скорости перемешивания среды и продолжительности обработки. Определено, что температура и продолжительность термического воздействия являются основными факторами, определяющими выход жира, количество которого увеличивается с ростом температуры, однако при этом ухудшается качество вследствие интенсивных гидролитических и окислительных процессов. Качество жира оценено по ключевым (кислотное и перекисное числа) и дополнительным (тиобарбитуровое, анизидиновое, йодное числа и число омыления) показателям. По совокупному анализу показателей качества жиров экспериментально показано, что наиболее благоприятным диапазоном термического воздействия на исследуемое сырье для выделения жира является температура от 70 до 100 °С. Выполненные исследования позволили определить параметры термического метода извлечения жира из трех типов отходов и получить жир при минимально возможных значениях кислотного и перекисного чисел, т.е. максимально сохранить качество. По оптимизированной технологии в Калининградском техническом университете (партнер проекта) наработаны экспериментальные партии трех образцов жира из исследованных отходов рыбопереработки. Определены выход, показатели качества и физико-химические свойства, биохимический и минеральный состав жира, состав жирных кислот липидов, установлены их специфичность и насыщенность. Экспериментальные партии жира переданы Институту биофизики СО РАН, в котором развернуты пионерные исследования применимости полученных жиросодержащих отходов для биотехнологического синтеза целевых продуктов – белка одноклеточных (SCP) и разрушаемых биопластиков (полигидроксиалканоатов, ПГА). В Институте биофизики СО РАН проведен отбор штаммов, обладающих высокой липолитической активностью и способностью к росту на жирах из отходов рыбопереработки в качестве единственного источника углерода. Из четырех штаммов из коллекции ИБФ СО РАН, эффективных продуцентов SCP и ПГА, отобраны два наиболее результативных – Cupriavidus necator B-10646 и IBP/SFU-1, обеспечивающих получение наиболее высоких урожаев биомассы клеток на исследованных субстратах. Разработаны питательные среды на основе стандартной солевой среды Шлегеля, содержащие в качестве источника углерода образцы полученного жира. Определены границы физиологического действия источников жира для штаммов и концентрации трех типов жира, обеспечивающие наиболее высокие выходы по урожаю биомассы клеток. На основе выявленных границ физиологического действия источников жира и форм источника азота проведены исследования продукционных характеристик культур двух отобранных штаммов при варьировании соотношения углерод/азот в среде. Связано это с тем, что целевые продукты (белок и полимеры) синтезируются в различных условиях (белок на полной питательной среде при условиях, приближающихся к оптимальным, а ПГА – при ограничении роста и конструктивного обмена дефицитом азота). Исследовано влияние на показатели продуктивности по урожаю биомассы, ПГА и «сырого» протеина источника жира и соотношения С/N в широком диапазоне (от 10 до 40). Установлены значения соотношений С/N в среде, обеспечивающие продуктивные процессы синтеза полимеров при лимитировании роста бактерий по азоту, и/или белка одноклеточных на полной питательной среде. Определено внутриклеточное содержание «сырого» протеина (общий азот клетки х 6,25), белка и его аминокислотный состав, который включает такие незаменимые аминокислоты как валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, и фенилаланин. Полимер, синтезированный на трех источниках жира, во всех случаях представлен трехкомпонентными ПГА, включающими, помимо доминирующих мономеров 3-гидроксибутирата (3ГБ) (порядка 97-98 мол.%), мономерные единицы 3-гидроксивалерата (3ГВ) от 1,5 до 2,2 мол.% и 3-гидроксигексаноата (3ГГ) 0,4-0,5 мол.%. Образцы ПГА имели высокие значения молекулярной массы (Мв до 660 кДа), порядка 70 % степень кристалличности и разрыв между температурой плавления (159-169 оС) и термической деградации (251-292 оС), не менее 100-130 оС. Исходя из того, что важным показателем биотехнологических процессов является полнота использования ростового субстрата, прежде всего углеродного, что напрямую влияет на конечный выход продукта и экономику процесса в целом, исследована динамика и полнота утилизации жировых субстратов в культуре C. necator B-10646. Установлено, что липиды, составляющие 95-96 % в образцах жира из отходов рыбопереработки, утилизируются бактериями в условиях колбочной лабораторной культуры на 50-60 % из жира, полученного из голов копченой кильки и внутренностей судака, и только на 20 % – из жира из голов скумбрии атлантической. При использовании жиров рыбопереработки, имеющих различные насыщенность и соотношение жирных кислот, показана избирательность потребления ЖК клетками: из всех трех жировых субстратов полиеновые ЖК утилизируются в процессах биосинтеза практически полностью, а насыщенные ЖК и моноеновая олеиновая кислота практически не утилизируются, накапливаясь в культуре. Это требует решений для повышения полноты использования жировых субстратов в процессах биосинтеза, что, по нашему мнению, может быть решено через повышение их доступности для клеток через оптимизацию микронизации жировой эмульсии и привлечение ферментеров с повышенными массообменными характеристиками. Исследованы способы эмульгирования жировых отходов и получаемых прямых эмульсий масло/вода (М/В) изменением скорости перемешивания и с применением химических эмульгаторов. Найдены параметры перемешивания, позволяющие получать эмульсии с минимальным размером капель, стабильные во времени. Показано влияние скорости эмульгирования жировых субстратов на полноту их усвоения в широких пределах, от 50-55 до 80-85 %. В качестве эмульгаторов исследованы пептиды, полученные в КГТУ путем гидролиза отходов рыбопереработки, представляющие собой тонкодисперсные порошки пептидов, отличающиеся молекулярной массой. Тип пептида влиял на эмульгирование жира и размер капель, при этом все типы полученных эмульсий не обладали длительной стабильностью. В культуре бактерий C. necator B-10646 исследовано четыре химических эмульгатора: твин-80, SDS, кокоглюкозид и кокоилглутамат натрия. Для определения возможного токсического эффекта бактерии выращивали на глюкозе с добавлением в среду исследуемых эмульгаторов. Токсический эффект SDS проявлялся сразу после его добавления в культуру, независимо от дозы. При росте культуры на кокоглюкозиде также наблюдалось ингибирование бактерий. Пригодными эмульгаторами, не оказывающими негативного влияния на бактерии, признаны твин-80 и кокоилглутамат натрия, при добавлении которых концентрация биомассы бактерий в конце культивирования была сопоставима с контролем. Поэтому эти два эмульгатора отобраны для дальнейших исследований, которые продолжатся в 2024 г. согласно плана НИР. Оба коллектива – ИБФ СО РАН и партнер проекта КГТУ, выполнили программы НИР в полном объеме, все задачи плана 2023 г. решены. Имеется полная готовность для выполнения программы НИР 2024 года.

 

Публикации

1. Волова Т. Г., Жила Н. О., Киселев Е. Г., Суковатый А. Г., Лукьяненко А. В., Шишацкая Е. И. Biodegradable Polyhydroxyalkanoates with a Different Set of Valerate Monomers: Chemical Structure and Physicochemical Properties International Journal of Molecular Sciences, International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24(18):14082 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms241814082

2. Волова Т. Г., Успенская М. В., Киселев Е. Г., Суковатый А. Г., Жила Н. О., Васильев А. Д., Шишацкая Е. И. Effect of Monomers of 3-Hydroxyhexanoate on Properties of Copolymers Poly (3-Hydroxybutyrate-co 3-Hydroxyhexanoate) Polymers, 5(13):2890 (год публикации - 2023) https://doi.org/https://www.mdpi.com/2073-4360/15/13/2890

3. Жила Н. О., Киселев Е. Г., Волков В. В., Мезенова О. Ю., Сапожникова К. Ю., Шишацкая Е. И., Волова Т. Г. Properties of Degradable Polyhydroxyalkanoates Synthesized from New Waste Fish Oils (WFOs) International Journal of Molecular Sciences, International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24(19):14919 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms241914919

4. Жила Н. О., Сапожникова К. Ю., Киселев Е. Г., Шишацкая Е. И., Волова Т. Г. Synthesis and Properties of Polyhydroxyalkanoates on Waste Fish Oil from the Production of Canned Sprats Processes, 11(7):2113 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/pr11072113

5. Жила, Н. О., Волков, В. В., Мезенова, О. Я., Киселев, Е. Г., Волова, Т. Г. Отходы рыбопереработки – перспективный субстрат для синтеза целевых продуктов биотехнологии Журнал Сибирского федерального университета. Биология, Journal of Siberian Federal University. Biology 2023 16(3): 386–397 (год публикации - 2023)

6. Киселев, Е. Г., Демиденко, А. В., Барановский, С. В., & Волова, Т. Г. Выделение и очистка полигидроксиалканоатов. Масштабирование в условиях пилотного производства Журнал Сибирского федерального университета. Химия, Journal of Siberian Federal University. Chemistry 2023 16(3): 438–446 (год публикации - 2023)

7. Мезенова О.Я., Агафонова С.В., Романенко Н.Ю., Калинина Н.С., Волков В.В. Обоснование рациональных режимов технического выделения липидов из жиросодержащих рыбных отходов Журнал «Рыбное хозяйство», Рыбное хозяйство. 2023. № 4. С. 99-106 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.37663/0131-6184-2023-4-99-106

8. Мезенова О.Я., Агафонова С.В., Романенко Н.Ю., Калинина Н.С., Волков В.В., Домбарович Л.В. Потенциал и перспективы использования жира из копченых рыбных отходов Известия КГТУ, Научный журнал «Известия КГТУ», № 70, С103-114 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.46845/1997-3071-2023-70-103-114

9. - Кильку в пластик Журнал «Наука и Жизнь», от 11 августа 2023 г., в он-лайн формате (https://www.nkj.ru/open/48524/?sphrase_id=6034802) (год публикации - )