Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Целью всего проекта является определение влияния функциональных детерминант мРНК, таких как вариативность длины последовательности Шайна-Дальгарно (ШД), длины спейсера ШД-AUG стартовый кодон, наличие вторичных структур с различиями в свободной энергии сворачивания, а также допускающих альтернативное декодирование инициаторного кодона AUG с возникновением сдвига рамки считывания на эффективность трансляции с определением их регуляторного механизма действия. На первом этапе выполнения проекта были получены в препаративных количествах 13 транскриптов мРНК, содержащих анализируемые изменения в функционально значимых участках. Для выполнения поставленных экспериментальных задач использовалась контролируемая модельная система in vitro для изучения парциальных этапов биосинтеза белка ранее созданная в нашей лаборатории и использующая набор современных высоко чувствительных методик флуоресцентной спектроскопии – микротермофореза, дифференциальной сканирующей флуориметрии и престационарной кинетики (Vinogradova et al., 2020). Для этого были получены препаративные количества флуоресцентно меченной инициаторной Bpy-Met-tRNAfMet и fMet-tRNAfMetPrf20 для использования в качестве репортерной молекулы в условиях созданной модельной системы. В ходе выполнения экспериментальных задач проекта от использования флуоресцентно меченных по 3′-концу анализируемых мРНК красителем флуоресцеином было принято решение отказаться в пользу альтернативных вариантов репортерных молекул. Однако, методика мечения была опробирована и определена на синтетическом гетерополимерном конструкте мРНК, используемом в нашей лаборатории. Для проведения анализа влияния изменений в регуляторных участках мРНК на эффективность синтеза первой и второй пептидных связей были получены в препаративных количествах радиоактивно меченная элонгационная [14C]Lys-tRNALys и Glu-tRNAGlu. Для получения индивидуальных tRNALys и tRNAGlu из E. Coli для их дальнейшего аминоацилирования прежде получали препарат тотальной тРНК. Все используемые компоненты модельной системы in vitro (30S, 50S, 70S, IF1, IF2, IF3, EF-Tu, EF-G) для анализа парциальных этапов трансляции в условиях влияния мРНК через соответствующие детерминанты были получены в нашей лаборатории. Препараты белков были проанализированы после каждого нового выделения на предмет конформационной целостности и агрегационной устойчивости методом дифференциальной сканирующей флуориметрии. Анализ аффинности лигандов при образовании 30S IC и 70S IC проводили с использованием метода микротермофореза, где в качестве репортерной молекулы использовали флуоресцентно меченную Bpy-Met-tRNAfMet (Vinogradova et. al., 2020). Эксперимент проводили в условиях возрастающей концентрации исследуемого лиганда. В результате были определены константы диссоциации (Кд) всех лигандов, участвующих в процессе инициации трансляции в зависимости от вариативности функциональных детерминант мРНК. Определено влияние изменений в последовательности Шайна-Дальгарно (ШД), длине спейсера между последовательностью ШД и инициаторным кодоном, а также в наличии структурированных участков с различной свободной энергией сворачивания на мРНК на эффективность протекания стадии инициации трансляции. Определена роль IF3 в условии вариативности изучаемых регуляторных участков мРНК, а также зависимость от присутствия GTP для эффективного образования зрелого 70S IC. Был проведен анализ эффективности образования 30S IC, 70S IC в зависимости от присутствия IF3 для всех анализируемых мРНК методом гель-фильтрационного анализа. В качестве репортерной молекулы использовались инициаторная Bpy-Met-tRNAfMet и fMet-tRNAfMetPrf20. Анализ кинетики образования 30S IC и 70S IC в зависимости от присутствия IF3 для анализируемых мРНК проводили с использованием репортерной молекулы Bpy-Met-tRNAfMet методом остановленного потока и светового рассеяния. В результате была определена скорость образования инициаторных комплексов в зависимости от изменений в регуляторных областях мРНК. Были обнаружены изменения сигнала флуоресценции в процессе образования инициаторного комплекса, отражающие изменения микроокружения флуоресцентного красителя Bodipy, связанного с метионином инициаторной тРНКfMet. Методом остановленного потока была детально охарактеризована кинетика формирования зрелого 70S инициаторного комплекса (70S IC). Были определены скорость аккомодации инициаторной тРНКfMet, а также ассоциации 50S субъединицы рибосомы методом светового рассеяния в зависимости от связанной мРНК. Был детально охарактеризован этап перехода сформированного 70S IC в стадию элонгации для всех изучаемых вариантов мРНК. Были получены скорости связывания элонгационной Lys-tRNALys в А сайт 70S IC в условиях повышения концентрации тройного комплекса EF-Tu-GTP-Lys-tRNALys методом остановленного потока. Дополнительно была охарактеризована степень диссоциации пептидил-тРНК из А сайта рибосомы с определением скорости и эффективности диссоциации в зависимости от связанной мРНК. В рамках выполнения экспериментальных задач первого этапа проекта была охарактеризована стадия транслокации, катализируемая элонгационным фактором G (EF-G) пре-транслокационных комплексов, сформированных с анализируемыми мРНК. В результате было определено влияние вариативности длины последовательности Шайна-Дальгарно, длины спейсера ШД-AUG, расположения и устойчивости вторичных структур на мРНК, а также вероятности возникновения альтернативного декодирования и сдвига рамки считывания на скорость и эффективность транслокации. После образования первой пептидной связи и продвижения рибосомального комплекса по мРНК был проведен анализ эффективности образования второй пептидной связи в условиях изучаемых различий в регуляторных элементах мРНК. В результате была определена зависимость образования второй пептидной связи от изменений в последовательности мРНК, а также определена степень компенсации их ингибирующего влияния на предыдущие стадии трансляции. Таким образом, были получены препаративные количества всех необходимых лигандов для моделирования условий трансляции in vitro в условиях изменений в функционально значимых участках мРНК. В результате были детально охарактеризованы стадии инициации, элонгации, транслокации для исследуемых мРНК с выявлением механизма их регуляции. Дополнительно в целях популяризации науки было принято участие в программе Ученый Совет на Радио Культура, где было дано интервью о реализуемом проекте (https://smotrim.ru/audio/2762096?utm_source=share).