КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 19-74-20146
НазваниеПостроение структурной базы для рационального дизайна биологически значимых макромолекул с использованием криоэлектронной микроскопии
РуководительШтам Татьяна Александровна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт", Ленинградская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2023 г. - 2025 г. |
Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (31).
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков
Ключевые словакриоэлектронная микроскопия, биоподобные структуры, рациональный дизайн, экзосома, вирусоподобная частица, нуклеопротеин, бета-галактозидаза, глюкоамилаза, мРНК, пептидные препараты
Код ГРНТИ34.17.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
В рамках настоящего проекта планируется использовать метод современной криоэлектронной микроскопии для:
1) исследования морфологии экстраклеточных везикул (ЭВ) и экзосом из различных источников, а также оценки эффективности нагрузки везикул экзогенными молекулами с определением локализации вводимого «груза»;
2) определения пространственного строения рибосомы млекопитающих в комплексах с предполагаемыми ингибиторами биосинтеза белка;
3) изучения структурно-функциональных взаимосвязей термостабильных ферментов с целью улучшения их характеристик путём рационального дизайна на основе структурных данных и результатов молекулярного моделирования.
1) Наноразмерные внеклеточные везикулы и экзосомы, секретируемые клетками организма в среду, изменяют картину межклеточных взаимодействий, развития тканей и органов, рост новообразований и определяют реакцию организма на стрессовые, токсические и лекарственные факторы. В планируемом исследовании, посвященном особенностям структуры и биохимического состава экзосом при различных патологических состояниях, будут предложены новые диагностические технологии, основанные на анализе изменений в составе белков, липидов и/или нуклеиновых кислот, переносимых экзосомами. Кроме того, на основе структурных данных, полученных с помощью криоэлектронной микроскопии, будут определены морфологические особенности внеклеточных везикул при некоторых заболеваниях, включая редкие патологии, для которых такие исследования не проводились ранее.
В ходе работ по Проекту 2019 и ранее были успешно апробированы некоторые способы нагрузки и доставки терапевтических белков или молекул siRNA в клетки человека с помошью везикул. Однако в этих исследованиях нам не удалось определить локализацию нагружаемых молекул в составе везикул. Решению вопроса о расположении экзогенного груза при разных техниках нагрузки везикул и планируется посвятить исследования в рамках проекта, используя для визуализации везикул и груза метод криогенной томографии.
2) Трансляционный аппарат млекопитающих является одной из мишеней при разработке противоопухолевых и антивирусных препаратов. В этом исследовании мы планируем определить молекулярный механизм противоопухолевого действия нескольких низкомолекулярных ингибиторов биосинтеза белка из класса квассиноидов и тетрациклинов, предположительной мишенью которых является рибосома. Для решения этой задачи будут проведены следующие работы: тестирование противоопухолевой активности ингибиторов на ряде клеточных линий человека и животных; проверка эффективности препаратов для ингибирования синтеза белка в системе in vitro; выделение и очистка рибосом из клеток млекопитающих, получение структуры рибосом млекопитающих в комплексе с ингибиторами при помощи анализа одиночных частиц (SPA). Внимание будет также уделено и связывающимся с рибосомой белкам. В частности, мы планируем изучить взаимодействие белка G3BP1, ключевого компонента стресс-гранул, с 40S субчастицей рибосомы.
3) Поиск ферментов с новыми свойствами для применения в биотехнологических задачах, особенно среди микроорганизмов с экстремальным ареалом обитания, остается по-прежнему актуальным, как и выяснение природы адаптации белковых молекул к агрессивным условиям среды. В этом направлении будут продолжены исследования высоко термостабильного мультидоменного фермента DaβGal, впервые нами клонированного из гипертермофильной археи D. amylolitus, и представляющего новый класс мультидоменных β-галактозидаз семейства GH35. Получение данных о структуре фермент-субстратного комплекса существенно облегчит проведение рационального дизайна для улучшения каталитических свойств фермента и понимания механизмов его функционирования. Другой задачей является увеличение выхода ферментного продукта. С этой целью планируется создание системы экспрессии и секреции фермента в термотолерантных дрожжах P. pastoris, а также исследовать получаемую в этом случае гликозилированную форму белка.
Ожидаемые результаты
Проект 2023 включает в себя три основные направления исследований, условно названных как:
1) «Экзосомы»
2) «рибосомы млекопитающих и ингибиторы биосинтеза белка»
3) «термостабильные ферменты».
По этим трем направлениям предполагается получить следующие результаты.
1) В планируемом исследовании, посвященном особенностям структуры и биохимического состава экзосом при различных патологических состояниях, на основе структурных данных, полученных с помощью криоэлектронной микроскопии, будут определены морфологические особенности внеклеточных везикул при некоторых заболеваниях, включая, редкие лизосомные болезни накопления, спорадическую форму болезни Паркинсона, сопряженную с мутациями в гене GBA, метаболические патологии (диабет второго типа, ожирение и/или гиперхолестеринемия) и онкологические заболевания (рак молочной железы и/или рак яичников). Кроме того, в результате выполнения проекта будут получены данные о белковом составе экстраклеточных везикул из культуральной среды и плазмы крови пациентов с разными подтипами рака молочной железы и/или рака яичников, а также получен липидный спектр экзосом плазмы крови пациентов с некоторыми типами лизосомных болезней накопления. Результаты этих исследований могут иметь значение для практического здравоохранения, поскольку создают предпосылки для создания диагностических панелей на основе состава и морф ологии экзосом из различных биологических жидкостей для неинвазивной диагностики и мониторинга терапии ряда заболеваний.
В части продолжения исследований по оптимизации нагрузки везикул из различных источников, включая растительные экзосомоподобные частицы, будут апробированы несколько способов нагрузки везикул терапевтическими белками или молекулами RNA, а также, при успешности работ, определена локализация нагружаемых молекул в составе везикул при использовании разных технологий нагрузки.
2) По второму направлению наших исследований мы ожидаем получить следующие результаты. Будут получены пространственные структуры комплексов 80S рибосомы человека с некоторыми квассиноидами (как минимум – с айлантоном и бруцеантином). Квассиноиды, являющиеся главными активными компонентами ряда растительных препаратов восточной медицины, рассматриваются сейчас как перспективные противоопухолевые средства, однако их внедрение в практику затруднено из-за отсутствия надёжной информации об их молекулярных мишенях. До настоящего момента была доступна только структура архейной рибосомы с бруцеантином (веществом, не прошедшим клинические испытания из-за высокой токсичности). В ходе предварительной работы, проведенной в рамках Проекта 2019, мы показали, что квассиноид айлантон (относящийся к другой группе квассиноидов, чем бруцеантин, и оказывающий значительно более мягкое воздействие на клетку) связывается с 80S рибосомой человека. Интерес представляют и другие квассиноиды – например, эврикуманон, хорошо известный спортсменам как тестостероновый бустер, а в восточной медицине применяемый для повышения либидо. Другая часть работы будет посвящена тетрациклинам, способным ингибировать эукариотическую трансляцию. Тетрациклины традиционно считаются ингибиторами бактериальной трансляции, однако некоторые сведения указывают на то, что некоторые из них (например, миноциклин и тигециклин) могут блокировать эукариотическую рибосому. В случае подтверждения литературных данных, свидетельствующих о влиянии миноциклина и тигециклина на трансляцию в клетках млекопитающих, будут получены структуры комплексов 80S рибосомы человека или крысы с этими ингибиторами. На случай неподтверждения у нас есть альтернативный план: комплексы с представителями группы трихотеценовых грибных токсинов (часто обнаруживаемых в зерне злаковых культур и поэтому имеющих значение для сельского хозяйства); их взаимодействие с рибосомой не вызывает сомнений. Ещё одним объектом изучения будут рибосом-связывающие белки. В частности, мы планируем изучить взаимодействие белка G3BP1 с 40S субчастицей рибосомы млекопитающих. Этот белок является ключевым компонентом стресс-гранул – РНК-белковых конденсатов, образующихся в клетках эукариот при стрессе и играющим важную роль в ответе клеток на самые разные воздействия. Несмотря на большой объём информации о составе стресс-гранул (компонентом которых являются, в частности, 40S субчастицы), структурные основы их формирования совершенно не изучены – в частности, нет информации о деталях взаимодействия G3BP1 с 40S субчастицами. Нарушения формирования стресс-гранул сопровождают некоторые заболевания человека (например, боковой амиотрофический склероз). Понимание структурных основ их формирования помогло бы пролить свет на молекулярные аспекты этих патологий.
3) В результате исследования структурно-функциональных взаимосвязей термоустойчивой β-галактозидазы из гипертермофильной археи Desulfurococcus amylolyticus и ее мутантных формах мы ожидаем получить данные о механизмах функционирования фермента и природе термостабильности белковых молекул в целом.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1) По направлению «экзосомы» в конце первого года выполнения проекта получены следующие результаты:
1.1. Проведен сравнительный анализ морфологии экзосом при таких метаболических патологиях как диабет и ожирение. Экстраклеточные везикулы (ЭВ) представляют собой мембранные везикулы клеточного происхождения, которые играют важную роль в межклеточных коммуникациях и физиологии. ЭВ доставляют биологическую информацию от клеток-продуцентов к клеткам-реципиентам путем транспортировки различных молекул, таких как белки, мРНК, микроРНК, некодирующие РНК и липиды. ЭВ жировой ткани могут регулировать метаболические и воспалительные взаимодействия внутри жировой ткани, а также в дистальных тканях. Таким образом, предполагается, что ЭВ жировой ткани причастны к патологиям, связанным с ожирением, особенно к инсулинорезистентности и сахарному диабету 2 типа (СД2). В данном исследовании мы впервые охарактеризовали ЭВ, секретируемые висцеральной (ВЖТ) и подкожной жировой тканью (ПЖТ) пациентов с ожирением и СД2, стандартными методами, а также проанализировали их морфологию с помощью криоэлектронной микроскопии. Криоэлектронная микроскопия позволила визуализировать гетерогенную популяцию ЭВ различного размера и морфологии, в том числе одиночные ЭВ и ЭВ с внутренней мембранной структурой в образцах пациентов с ожирением, а также в контрольной группе. Преобладали единичные везикулы (до 85% для ПЖТ, до 75% для ВЖТ), а для ВЖТ характерна более высокая доля ЭВ с внутренними мембранными структурами по сравнению с ПЖТ. Уменьшенный размер одинарных и двойных везикул ПЖТ по сравнению с везикулами ВЖТ, большая доля многослойных везикул и всех видов частиц со структурами внутренней мембраны, секретируемыми ВЖТ, отличали пациентов с ожирением с/без СД2 от контрольной группы. Эти результаты могут поддержать идею модифицированного биогенеза внеклеточных везикул при ожирении и сахарном диабете 2 типа. Полученные данные вошли в опубликованную статью по проекту: Miroshnikova VV, Dracheva KV, Kamyshinsky RA, Yastremsky EV, Garaeva LA, Pobozheva IA, Landa SB, Anisimova KA, Balandov SG, Hamid ZM, Vasilevsky DI, Pchelina SN, Konevega AL, Shtam TA. (2023) Cryo-electron microscopy of adipose tissue extracellular vesicles in obesity and type 2 diabetes mellitus. PLoS ONE 18(2): e0279652. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0279652
1.2. С помощью криоэлектронной микроскопии впервые были получены данные о морфологии экстраклеточных везикул (ЭВ) плазмы крови пациентов с болезнью Паркинсона (БП), ассоциированной с мутациями в гене GBA1 (GBA-БП) и бессимптомных носителей мутаций в гене GBA1 (GBA-носители). ЭВ плазмы крови исследуемых групп пациентов были получены методом ультрацентрифугирования. Было показано, что ЭВ пациентов с GBA-БП отличаются по своей морфологии от контроля и GBA-носителей, характеризуясь усложнением структуры ЭВ. ЭВ плазмы крови пациентов с GBA-БП также отличались большим диаметром по сравнению как с лицами контрольной группы, так и GBA-носителями (p=0,038, p<0,0001, соответственно).
1.3. Для изучения морфологии ЭВ плазмы крови пациентов с лизосомными болезнями накопления (ЛБН) были подготовлены образцы для криоэлектронного анализа ЭВ плазмы крови пациентов с болезнью Гоше и болезнью Фабри. В дальнейшем будет проведена характеристика морфологии ЭВ указанных групп пациентов, а также будут включены пациенты с более редкими ЛБН.
1.4. В рамках работы была произведена сравнительная оценка возможности использования PEVs различных продуцентов для нагрузки экзогенным белком и его доставки на клеточных моделях.В том числе, были получены и охарактеризованы по размеру и концентрации растительные везикулы из 7-ми продуцентов, включая микроводоросли. Размер частиц не превышает 150 нм. Максимальное количество везикул удалось получить из 500 мл сока Viburnum opulus (калина) и Cucumis sativus (огурец): 1014 и 2,5X1013 частиц соответственно. Наибольшая эффективность инкапсуляции экзогенного белка HSP70 продемонстрирована для Allium sativum, Cucumis melo и Chlorella vulgaris, наименьшая эффективность - Citrus paradisi и Solаnum lycopеrsicum. Наиболее эффективная доставка экзогенного HSP70 для клеток линии глиобластомы А172 осуществляется везикулами микроводорослей, а для клеточной линии рака кишечника SW480 везикулами микроводорослей и Allium sativum. Наибольшему увеличению эффективности накопления HSP70 в цитоплазме клеток, по сравнению со свободным белком, способствуют везикулы Citrus paradisi (грейпфрут) и Solаnum lycopеrsicum (томат). Корреляции между эффективностью нагрузки и эффективностью доставки экзогенного HSP70 к клеткам человека обнаружено не было. Корреляция между размером везикул и эффективностью нагрузки/доставки экзогенного HSP70 к клеткам человека отсутствует.
2) По направлению исследований, «рибосомы млекопитающих и ингибиторы биосинтеза белка»:
Показано ингибирование трансляции репортерной мРНК четырьмя квассиноидами (айлантон, эурикуманон, бруцеантин и бруцеин А) в эукариотических бесклеточных системах, в том числе приготовленных из клеток и органов млекопитающих, и в дрожжевой системе – что говорит об универсальности механизма ингибирования биосинтеза белка квассиноидами. Вещества продемонстрировали подавление трансляции на 50% при концентрациях от десятых долей до единиц мкМ.
Разработан метод тоу-принтинга в клеточном лизате с использованием флуоресцентно-меченного праймера. С помощью этого метода продемонстрирована остановка рибосомы при добавлении каждого из четырёх изученных квассиноидов, что указывало на вероятный механизм действия, связанный с ингибированием элонгации.
В ходе проведения работ по проекту мы определили, что айлантон, квассиноид из растения Ailanthus altissima, проявляет дозозависимую противоопухолевую активность в клеточных моделях опухолей человека различной локализации. При этом, для всех семи исследованных клеточных культур наблюдали индукцию айлантоном накопления клеток в G0/G1-фазе клеточного цикла.
Из культуры клеток человека выделены 80S рибосомы. Впервые получены структуры комплексов 80S с квассиноидом айлантоном. Разрешение структур составило до 2.34 ангстрема в случае 80S и до 2.07 ангстрема в случае 60S субчастицы. Определены межмолекулярные контакты и элементы рибосомы, принимающие участие в связывании (нуклеотиды U4446, G4393, G3907 и псевдоуридин 4450).
3) По направлению «термостабильные ферменты»:
Ранее мы показали, что сконструированная на основе анализа структурных данных мутантная форма фермента DaGal E149Q с заменой в позиции 149 каталитической аминокислоты Glu на Asp, не способна расщеплять лактозу. Это дает возможность изучать структуру фермент-субстратного комплекса с этим важным природным дисахаридом. Для регистрации лиганда в активном центре фермента мы провели Крио-ЕМ исследование такого комплекса, однако полученные результаты требуют дополнительного тщательного анализа и интерпретации. Также использование метода молекулярной динамики с явным учетом молекул растворителя позволило нам выявить особенности расположения лактозы в активном центре фермента дикого типа и его мутантной формы E149Q. Эти результаты согласуются с биохимическими данными, где мы показали конкурентный тип ингибирования лактозой гидролиза хромогенного субстрата oNPG и определили константу такого ингибирования, которая составила 125±13 мМ.
Публикации
1. Мирошникова В.В., Драчева К.В., Камышинский Р.А., Ястремский Е.В., Гараева Л.А., Побожева И.А., Ланда С.Б., Анисимова К.А., Баландов С.Г., Хамид З.М., Василевский Д.И., Пчелина С.Н., Коневега А.Л., Штам Т.А. Cryo-electron microscopy of adipose tissue extracellular vesicles in obesity and type 2 diabetes mellitus PLoS ONE, PLoS ONE 18(2): e0279652 (год публикации - 2023)
2. А.Д. Изюмченко, А.Э. Копытова, Д.Г. Кулабухова, Л.А. Гараева, И.В. Милюхина, Е.Б. Пичкур, С.Н. Пчелина, Т.А. Штам. Криоэлектронная микроскопия экстраклеточных везикул плазмы крови при болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA1 © НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ: Сборник тезисов «X Всероссийского молодежного научного форума с международным участием “Open Science 2023”, Сборник тезисов «X Всероссийского молодежного научного форума с международным участием “Open Science 2023”, 15–17 ноября 2023, г. Гатчина. С. 100. (год публикации - 2023)
3. Гараева Л.А., Комарова Е.Ю., Емельянова С.С., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Коневега А.Л., Штам Т.А. РАСТИТЕЛЬНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ – ПЕРЕНОСЧИКИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА HSP70 Сборник тезисов 26-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием, с.18-19 (год публикации - 2023)
4. Е.Д. Путевич, Л.А. Гараева, А.С. Спицына, Е.А. Толстыко, С.С. Емельянова, Л.А. Соломина, Е.Ю. Комарова, И.А. Сизова, Т.А. Штам ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ПЕРЕНОСЧИКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ Образование и наука – стратегическая платформа для будущего Фармации» : сборник тезисов, Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летию создания фармацевтического отделения на факультете фундаментальной медицины МГУ, с.145-147 (год публикации - 2023)
5. Л.А. Гараева, Е.Ю. Комарова, С.С. Емельянова, И.В. Гужова, Б.А. Маргулис, А.Л.Коневега, Т.А. Штам РАСТИТЕЛЬНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ – ПЕРЕНОСЧИКИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА HSP70 Образование и наука – стратегическая платформа для будущего Фармации» : сборник тезисов, Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летию создания фармацевтического отделения на факультете фундаментальной медицины МГУ, с. 44-46 (год публикации - 2023)
6. Сорокин И.И., Пичкур Е.Б., Гараева Л.А., Красота А.Я., Штам Т.А., Дмитриев С.Е. STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ASPECTS OF EUKARYOTIC RIBOSOME INHIBITION BY QUASSINOIDS Book of abstracts: RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY, Book of abstracts: RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY, p.9 (год публикации - 2023)
7. Штам Т.А., Драчева К.В., Камышинский Р.А., Ястремский Е.В., Гараева Л.А., Побожева И.А., Ланда С.Б., Анисимова К.А., Баландов С.Г., Хамид З.М., Василевский Д.И., Пчелина С.Н., Коневега А.Л., Мирошникова В.В. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles of adipose tissue in obesity and type 2 diabetes Book of abstracts: RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY, Book of abstracts: RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY, p.50 (год публикации - 2023)