КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-74-30011

НазваниеТерапевтические нуклеиновые кислоты для регуляции процессов воспаления, метастазирования и управления иммунитетом

РуководительВласов Валентин Викторович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2023 г. - 2025 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (33).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаВоспаление, онкологическая трансформация, метастазирование, хроническая обструктивная болезнь легких, иммуносупрессия, мРНК, миРНК, белки check-points, терапевтические нуклеиновые кислоты, siРНК, антисмысловые олигонуклеотиды, конъюгаты, промышленные аэрозоли, наночастицы.

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
На всех этапах взаимодействия между иммунитетом, воспалительными реакциями и опухолевой прогрессией принимают участие молекулы РНК. Среди этих РНК особое место занимают микроРНК, регулирующие эти процессы за счет подавления экспрессии их мРНК-мишеней, а также мРНК, кодирующие ключевые белки, контролирующие направления развития этих процессов. Несмотря на обилие данных о функционировании ансамблей миРНК и мРНК при онкотрансформации клеток, развитии острого и хронического воспаления и аутоиммунных заболеваний, ключевые игроки этой триады до сих пор не найдены, и данные о возможности коррекции этих патологических состояний путем подавления функции определенных РНК малочисленны. Целью данного проекта является создание на основе нуклеиновых кислот (ТНК) РНК-направленных регуляторов процессов воспаления, опухолевой трансформации и средств активации иммунной системы в условиях иммуносупрессии, вызванной и воспалением, и опухолевым процессом. Проект предполагает проведение исследований полного цикла от расширенного поиска ключевых РНК, определяющих направления развития патологического процесса, и дизайна терапевтических нуклеиновых кислот до выяснение терапевтического потенциала создаваемых препаратов на релевантных моделях заболеваний in vivo, а также использование результатов фундаментальных исследований в клинической практике. Выполнение исследований по проекту будет проходить по трем основным направлениям: Направление 1. Фундаментальные исследования, направленные на выяснение взаимосвязи хронического воспаления, фиброза, онкотрансформации и иммуносупрессии и разработка подходов для регуляции этих процессов с помощью РНК-направленных препаратов на основе ТНК. Направление 2. Ориентированные фундаментальные исследования, направленные на выяснение в эксперименте роли аэрозолей, содержащих наночастицы различной природы, в развитии воспаления в дыхательных путях, его хронизации, а также создание панелей маркеров воспаления/раннего фиброза, позволяющих диагностировать эти состояния и оценивать ответ на лечение. Направление 3. Трансляционные исследования, направленные на доведение препаратов лидеров - анти-TIMP1-siРНК и миРНК-направленных олигонуклеотидов, до практического использования. Актуальность Исследования последних лет показали, что терапевтические препараты на основе ТНК кислот могут обеспечивать высокую эффективность и специфичность действия там, где обычные средства терапии не эффективны. Примерами могут служить МИР-19 - инновационный российский препарат, препараты компании Alnylam на основе siРНК и многие другие. Ввиду вышесказанного, создание эффективных и селективных препаратов на основе ТНК, препятствующих развитию воспаления, опухолевой прогрессии и иммуносупрессии, является актуальной, и открывает новые возможности в лечении этих заболеваний. Эта задача реалистична, как показывают вышеупомянутые примеры. Научная новизна Научная новизна поставленных задач и предлагаемых способов их решения заключается в том, что впервые предлагается замена или дополнения не вполне эффективных традиционных средств лечения инновационными препаратами синтетических ТНК, селективно действующими на ключевые РНК, запускающие и активирующие триаду воспаление – онкотрансформация – иммуносупрессия. Ввиду того, что эти процессы тесно связаны друг с другом, предлагается использовать ансамбли (коктейли) ТНК, одновременного действующие на все компоненты этой триады Первые обнадеживающие результаты в этом направлении были получены заявителями настоящего проекта в рамках проекта 2019 г. Опыт лаборатории-заявителя в выполнении подобных исследований, подтверждается успешным выполнением проекта 2019 г., публикациями в высокорейтинговых журналах, и существенным научно-техническим заделом по теме проекта. Все это позволяет рассчитывать на выполнение нового проекта в полном объеме и получение результатов мирового уровня.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта будут проведены фундаментальные исследования, направленные на выяснение взаимосвязи воспаления, фиброза, онкотрансформации и иммуносупрессии и разработаны способы регуляции этих процессов с помощью препаратов на основе терапевтических нуклеиновых кислот (малых интерферирующих РНК, антисмысловых олигонуклеотидов нового поколения, иммуностимулирующих РНК, а также их конъюгатов с молекулами, обеспечивающими эффективность их биологического действия in vivo). Будут идентифицированы РНК-мишени, связанные с развитием фиброза легких и определяющие функции таких иммунокомпетентных клеток, как миелоидные иммуносупрессорные клетки, N1-подобные нейтрофилы), опухоль-ассоциированные макрофаги и Т регуляторные клетки, и созданы средства регуляции их экспрессии в качестве инструментов для предотвращения развития фиброза легких. На релевантных моделях воспаления in vivo будет выяснена роль Timp1 как одного из универсальных регуляторов воспаления и фиброза, а также изучены молекулярные механизмы развития фиброза легких и других органов и сделаны выводы об общих и отличительных чертах эти процессов. Будут определены ключевые регуляторы эпителиально-мезенхимального перехода пневмоцитов – процесса, вовлеченного в развитие легочного фиброза и метастазирование клеток аденокарциномы легких. Будут выяснены связи воспалительных и гиперпластических процессов при развитии воспалительного процесса в легких, кишечнике, и печени. Будет выяснен терапевтический потенциал миРНК-направленных олигонуклеотидов в качестве ингибиторов процессов воспаления, а также ранних стадий онкотрансформации тканей, находящихся в состоянии воспаления. Будет изучен потенциал сочетаний миРНК-направленных олигонуклеотидов или/и иммуностимулирующей РНК в качестве ингибиторов иммуносупрессии, индуцируемых воспалением, опухолевым ростом, полихимиотерапией. Основные усилия при проведении ориентированных фундаментальных исследований, будут направлены на выяснение роли аэрозолей, содержащих наночастицы различной природы, в развитии воспаления в дыхательных путях, на создание панелей маркеров воспаления/раннего фиброза, позволяющих диагностировать эти состояния, и оценивать ответ на лечение, а также создание системы оценки риска осложнений при неблагоприятных вариантах течения ПХОБЛ. Будет разработана панель маркеров воспаления/раннего фиброза, позволяющих диагностировать эти состояния и ответ на лечение по анализу пула нуклеиновых кислот крови. Будет разработана система прогноза риска злокачественных новообразований и сердечно-сосудистых заболеваний при неблагоприятных вариантах профессиональной и профессионально обусловленной ХОБЛ, что позволит индивидуализировать программы управления профессиональным риском ПХОБЛ и ведения больных с ПХОБЛ (вторичной, третичной профилактики, диагностики, прогноза исходов, лечения) Будет проведено фракционирование частиц промышленных аэрозолей, определены их состав, размеры, физико-химические свойства, проведена наработка различных фракций наночастиц и выяснена роль аэрозолей, содержащих наночастицы различной природы, в развитии воспаления в дыхательных путях, его хронизации, фиброза или онкотранформации. Будут определены наиболее эффективные материалы и технологии их изготовления для создания фильтров для защиты органов дыхания от промышленных наночастиц. В результате проведения трансляционных исследований будут получены данные по препаратам лидерам, идентифицированным в ходе выполнения проекта 2019 г. - анти-TIMP1-siРНК и противоопухолевым миРНК-направленным олигонуклеотидам, доказывающие их терапевтический потенциал и необходимые для перехода к доклиническим исследованиям. Будет оптимизирована система доставки siРНК в клетки легкого in vivo при интраназальном или ингаляционном введении и выяснен ее терапевтический потенциал по доставке анти-TIMP1-siРНК на модели острого повреждения легких. Будет определен спектр опухолей, отвечающих снижением пролиферативного, и миграционного потенциалов на действие миРНК-ингибиторов и определены соотношения миРНК –направленных олигонуклеотидов в коктейле для терапии определённого типа опухолей. Будет изучена динамика накопления миРНК-направленных олигонуклеотидов в опухолевых клетках и тканях in vivo при различных методах введения препаратов и определена оптимальная система доставки и схема введения препаратов при проведении терапии. Будет проведен анализ влияния препаратов на продолжительность жизни животных-опухоленосителей и выяснены наличие/отсутствие побочных и неспецифических эффектов. В ходе выполнения исследований по проекту будут получены приоритетные результаты, которые, с одной стороны, будут соответствовать мировому уровню, а в чем-то и превосходить его, а с другой стороны, будут получены результаты большого практического значения: а именно, планируемое комплексного исследования предполагает проведение исследований на моделях заболеваний in vivo и в клинике, что значительно повышает значимость его результатов. В практическом плане будут получены данные для создания диагностических систем, протоколы обследования больных, учитывающие риск развития злокачественных новообразований и сердечно-сосудистых заболеваний при неблагоприятных вариантах ХОБЛ, и прототипы лекарственных препаратов для предотвращения развития фиброза легких, лечения онкологических заболеваний и управления иммуносупрессией. Будут получены данные о наиболее эффективных материалах и технологии их изготовления для создания фильтров для защиты органов дыхания от наночастиц.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проведен скрининг 4 источников воспаление-ассоциированных нейтрофилов и 3 протоколов их выделения. Разработан оптимальный протокол позитивной иммуномагнитной селекции для выделения нейтрофилов из селезенки. Обработано 35 препаратов биоптатов РШМ, получено 10 первичных культур клеток, которые охарактеризованы по экспрессии фибронектина, αSMA и Vimentine. Проведено моделирование фиброза легких с использованием липополисахарида и блеомицина и установлены оптимальные схемы индукции. Проанализированы данные полногеномного микрочипирования, полученные на мышиных моделях фиброза печени и почек. Гены Col1a1, Col3a1, Col4a1, Col4a2, Spp1, Sparc и Lpl выбраны в качестве потенциальных генов-регуляторов развития фиброза. На основании анализа независимых наборов данных, полученных на мышиных моделях гриппа транскрипционные факторы E2f1, E2f4, Nfya, Nfyb и Nfyc, и гены Birc5, Cdca3, Mcm5, Nusap1, Plk1, Prc1, Rrm2, Spag5, Top2a и Tpx2 выбраны для валидации как маркеры развития и тяжести заболевания. Проанализирована ассоциация ADAMTS6 и JUND с легочным фиброзом у человека. Показано, что ADAMTS6 формирует единственную связь с протеазой FURIN, что указывает на его возможную роль эффектора. JUND связан с 18 генами, которые участвуют в ответе клетки на стимулы путем регуляции AP1, ATF2, TGF-β, MAPK и других сигнальных путей. Проведена оценка динамики изменений в легких мышей на модели постгриппозной пневмонии. Патологические изменений в острую фазу представлены нейтрофильной инфильтрацией, кровоизлияниями, интерстициальным и альвеолярным отеком легких. В подострую фазу превалируют гиперпластические изменения. Затем, в легких появляются очаги пролиферации эпителия, а к 14 суткам очаги гиперплазии занимают значительную долю легочной паренхимы. Наибольшее снижение уровней миРНК-мишеней в клетках Caco-2 под действием анти-миРНК ASO наблюдается к 48 ч и составляет 50%, 70% и 40% для miR-21, miR-17 и miR-155, соответственно. Показало, что ASO оказывают дозозависимый антипролиферативный эффект в клетках Caco-2, до 40%, для µ-21 и µ-155, и 30% для µ-17. µ-21 и µ-17 снижают мобильность клеток на 15-20%, а µ-155 не влияет на миграцию. Изменение протеомного профиля клеток после анти-миРНК-терапии, показало, что специфический эффект в группе Combi опосредован влиянием на такие процессы как VEGF сигнальный путь, регуляция организации актинового цитоскелета и митохондрий и поддержание клеточной полярности. Показано, что трех-курсовая ПХТ приводит к увеличению количества MDSC в селезенке в 2-3 раза, причем наиболее высокий рост наблюдался в группе здоровых мышей – до 15% ядерных спленоцитов составляли PMN-MDSC и до 3,5% – M-MDSC. Введение µ-21-ON снижает количество MDSC в селезенке животных опухоленосителей до 5.78%, а введение µ-21-ON совместно с ПХТ - до 13%. Циклофосфамид играет ключевую роль в накоплении PMN-MDSC и M-MDSC в селезенке, тогда как доксорубицин, винкристин и преднизолон практически не влияют. Охарактеризованы наночастицы угольной пыли из различных источников. В составе суспензий, содержащих частицы УП с размерами <10 мкм, найдены потенциально опасные металлы. В макрофагах, инкубированных в присутствии УП, содержание Al, Fe, Si увеличивается с увеличением концентрации частиц в среде: при концентрации УП 8×10-4 мг/мл, содержание элементов превышает контроль на два порядка для Al, Si и в 2 раза для Fe. В легочной ткани экспериментальных животных обнаружено накопление Al, Fe, Si и Cu, при этом концентрации Al отличаются от контроля на 1-2 порядка, для Fe, Si, Cu отличия составляют 2-3 раза. Уровень накопления металлов в клетках и тканях коррелирует с дозой и кратностью введения. Множественный корреляционный анализ в подгруппе ПХОБЛ, вызванной преимущественно аэрозолями наночастиц металлов, показал сильную связь процента фиброза легочной ткани с массовой концентрацией наночастиц, сывороточными концентрациями N-терминального пропептида проколлагена 3-го типа, трансформирующего фактора роста-β1, интерлейкина-5, и связь средней силы – со стажем работы. В подгруппе ПХОБЛ, вызванной преимущественно аэрозолями наночастиц кремния, выявлена сильная корреляция процента легочного фиброза с массовой концентрации наночастиц, концентрацией N-терминального пропептида проколлагена 3-го типа, фактора роста фибробластов-2 и моноцитарного хемотаксического протеина-1, связь средней силы – со стажем работы, сывороточными концентрациями трансформирующего фактора роста-β1. Профилактические мероприятия могут быть направлены на снижение концентрации наночастиц в промышленном аэрозоле и/или «защите временем». Выявлен ряд генов (MEF2A, PELI1, ITLN1), уровень экспрессии которых дифференциально повышается в PBMC больных ХОБЛ. Эти гены могут рассматриваться в качестве перспективных маркеров для диагностики. Для увеличения эффективности биологического действия Timp1 направленной siРНК проведена оптимизация последовательности анти-Timp1 siРНК и паттерна химических модификаций. Показано, что siTIMP1_2 наиболее эффективно снижает уровень мРНК Timp1 в клетках RAW (IC50 = 0.2 нМ). Выбраны и синтезировано 9 последовательности siРНК, направленных против мРНК Dap12, определена их биологическая активность в клетках RAW 264.7 и найдена siDAP12_2 наиболее эффективно (80%) снижающая уровень мРНК Dap12. Синтезированы холестериновые конъюгаты siРНК и конъюгаты siРНК с двумя додецильными остатками на 5’- или 3’-конце смысловой цепи. Показано, что siРНК, содержащая триазиновый заместитель с двумя додецильными остатками на 5’ конце снижает экспрессию гена-мишени на 76%, в то время как siРНК с додецильными хвостами на 3’ конце не активна. Показано, что холестериновые конъюгаты siРНК обладают достоверно большей активностью, чем конъюгат с додецильными остатками. Исследовано влияние состава катионных липосом на эффективность доставки и накопления siРНК в клетках легкого in vivo и ее биологическую активность при интраназальном и внутривенном введении. Установлено, что наиболее эффективным способом доставки в ткани легкого является интраназальное введение с использованием липосом 2X3-DOPE. При введении комплексов с siTIMP за 7 дней до индукции острого воспаления, экспрессия Timp1 снижалась на 40%. На опухолевых клетках различного гистогенеза проведён скрининг антипролиферативной активности комбинаций ASO, содержащих мезильную модификацию. Наименьшую чувствительность к попарным комбинациям ASO проявляли клеточные линии глиобластом U118 и U87, а наибольшую чувствительность к действию коктейлей - клеточные линии В16, A549, CT-26, KB-3-1, и Caco-2. Наибольший анти-пролиферативный эффект на опухолевые клетки оказывали комбинации µ-21+ µ-17 и µ-21+µ-155. Динамика накопления ASO коррелирует со скоростью клеточного роста и деления, а ингибирующий эффект µ-21 - с накоплением ASO в клетках и скоростью роста. В медленно делящихся клетках Caco-2 с постоянным уровнем µ-21 наблюдается продолжительное подавление миРНК-21 с максимумом 50% через 48 ч. В агрессивно растущих клетках KB-8-5 и CT-26 наблюдается быстрое снижение уровня миРНК-21 (70-80% через 24-48 ч), к 72 ч уровень восстанавливается.

Публикации

1. Бишани А., Макарова Д.М., Шмендель Е.В., Маслов М.А., Сенькова А.В., Савин И.А., Гладких Д.В., Зенкова М.А., Черноловская Е.Л. Influence of the Composition of Cationic Liposomes on the Performance of Cargo Immunostimulatory RNA Pharmaceutics, V. 15, e2184 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/pharmaceutics15092184

2. Колесникова М.А., Сенькова А.В., Поспелова Т.И., Зенкова М.А. Effective prognostic model for therapy response prediction in acute myeloid leukemia patients J. Pers. Med., V. 13, 1234 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/jpm13081234

3. Марков А.В., Одаренко К.В., Сенькова А.В., Ильина А.А., Зенкова М.А. Исследование противоопухолевого потенциала солоксолон триптамида в отношении мультиформной глиобластомы с помощью in silico, in vitro и in vivo подходов Биохимия, V. 88, № 7, P. 1237-1253 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.31857/S0320972523070126

4. Марков А.В., Савин И.А., Зенкова М.А., Сенькова А.В. Identification of Novel Core Genes Involved in Malignant Transformation of Inflamed Colon Tissue Using a Computational Biology Approach and Verification in Murine Models Int. J. Molecular Sciences, V. 24, e4311, P. 1-22 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms24054311

5. Сенькова А.В., Савин И.А., Одаренко Л.В., Соломатина О.В., Салахутдинов Н.Ф., Зенкова М.А., Марков А.В. Protective effect of soloxolone derivatives in carrageenan- and LPS-driven acute inflammation: Pharmacological profiling and their effects on key inflammation-related processes Biomedicine & Pharmacotherapy, V. 159, e114231, P. 1 – 19 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.biopha.2023.114231

6. Черников И.В., Староселец Я.Ю., Татарникова И.С., Сенькова А.В., Савин И.А., Марков А.В., Логашенко Е.Б., Черноловская Е.Л., Зенкова М.А., Власов В.В. siRNA-Mediated Timp1 Silencing Inhibited the Inflammatory Phenotype during Acute Lung Injury Int. J. Molecular Sciences, V. 24, e1641, P. 1-27 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms24021641

7. Одаренко К.В., Зенкова М.А., Марков А.В. The Nexus of Inflammation-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition and Lung Cancer Progression: A Roadmap to Pentacyclic Triterpenoid-Based Therapies International Journal of Molecular Sciences, 24(24), 17325 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms242417325

8. Ощепкова А.Л., Зенкова М.А., Власов В.В. Extracellular Vesicles for Therapeutic Nucleic Acid Delivery: Loading Strategies and Challenges Int. J. Molecular Sciences, V. 24, e7287, P. 1 - 34 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms24087287

9. Савин И.А., Зенкова М.А., Сенькова А.В. Bronchial asthma, airway remodeling and lung fibrosis as successive steps of one process Int. J. Mol. Sci., V 24, 16042 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3090/ijms242216042

10. Шпагина Л.А., Зенкова М.А., Логашенко Е.Б., Сапрыкин А.И., Цыганкова А.Р., Шпагин И.С., Котова О.С., Кузнецова Г.В., Аникина Е.В., Камнева Н.В. Способ прогнозирования развития профессиональной хронической обструктивной болезни легких у лиц, работающих в условиях воздействия промышленных аэрозолей, содержащих наночастицы с кремнием -, RU 2803246 C (год публикации - )

11. - Новосибирские ученые разработали перспективное соединение для лечения тяжелой дыхательной недостаточности Интерфакс Россия, НОВОСТИ 29 июня 2023 г. 10:18 (год публикации - )

12. - Разработано новое соединение для борьбы с дыхательной недостаточностью. В его основу входит вещество, добываемое из корня солодки ТАСС Наука, ПАНДЕМИЯ COVID-19, 30 ИЮНЯ 2023, 00:32 (год публикации - )

13. - Сибирские ученые синтезировали соединение, помогающее при дыхательной недостаточности Наука в Сибири, 29.06.2023 (год публикации - )