КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-74-30003

НазваниеЭпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний

РуководительКирпичников Михаил Петрович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2023 г. - 2025 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (33).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словабиоинженерия, эпигенетика, хроматин, белок р53, белковый комплекс FACT, гистон, нуклеосома, кураксин, флуоресцентная микроскопия одиночных молекул, шапероны, трехмерная структура, криоэлектронная микроскопия, компьютерное моделирование, футпринтинг

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Эпигенетические исследования призваны установить молекулярные механизмы включения/ выключения генов и адаптивной регуляции функции генома. Актуальными являются эпигенетические исследования регуляции генов, продукты которых вовлечены в патогенез различных, и, в частности, онкологических заболеваний. Новым этапом развития медицинской генетики является формирование эпигенетического подхода, в котором геном описывается как динамичная программа, реализуемая в условиях строго упорядоченных регуляторных взаимоотношений между генами и их продуктами (РНК, белками, надмолекулярными структурами). Задачами проекта являются исследования на молекулярном уровне фундаментальных эпигенетических механизмов функционирования клеток эукариот, многие из которых лежат в основе развития онкологических заболеваний и дают основу для разработки новых подходов к диагностике онкологических заболеваний и идентификации новых мишеней противораковых препаратов следующего поколения. Наши исследования направлены на анализ эпигенетической регуляции транскрипции и репарации генов про-опухолевыми фактороми FACT и PARP1, а также регулятором транскрипции онкосупрессором р53. Будет изучена роль архитектурных белков семейства HMGB и линкерных гистонов в регуляции конформационной динамики хроматина, в том числе во время транскрипции. Новизна проекта определяется постановкой актуальных и практически значимых задач, нацеленных на установление особенностей взаимодействия факторов FACT, PARP1 и р53 друг с другом и с нуклеосомами, т.е. структурами, которые потенциально способны модулировать активацию генов, в том числе при развитии патологий. В рамках проекта взаимодействия FACT, PARP1 и р53 с хроматином будут охарактеризованы как со структурной (влияние на структуру эпигенетически отличающихся нуклеосом), так и с функциональной (влияние на процесс транскрипции) точек зрения. С использованием современных физико-химических методов микроскопии одиночных частиц и их комплексов на основе Фёрстеровского резонансого переноса энергии (FRET), анализа электрофоретической подвижности в геле (в том числе с измерением FRET на уровне отдельных молекул), футпринтинга, методов интегративного моделирования и криоэлектронной микроскопии будут определены механизмы действия факторов FACT, PARP1 и р53 на структуру нуклеосом, в том числе в присутствии регуляторных белков, вариантов гистонов и их пост-трансляционных модификаций. Будет определен вклад внутренней подвижности нуклеосом и тетрасом в динамику данных процессов и изучены предпосылки активации регулируемых этими белками генов на уровне нуклеосом. Будет проведено исследования влияния фактора FACT на транскрипцию нуклеосомной ДНК, содержащей различные повреждения ДНК, и будет определена роль различных участков гистонов в этом процессе. В ходе решения технических, методических и фундаментальных научных задач по ходу проекта будут существенно усовершенствованы методики микроскопии одиночных частиц и их комплексов на основе FRET для изучения конформационной динамики нуклеосом, а также уточнены динамические модели организации нуклеосом, включая детали внутренней динамики нуклеосом, субнуклеосом (тетрасом и гексасом) и строения линкерной области ДНК. Полученная нами информация о функционировании FACT и PARP1 на молекулярном и нуклеосомном уровне послужит основой для определения механизмов действия противоопухолевых препаратов. Будет существенно уточнен механизм действия противоопухолевых соединений кураксинов, мишенью которых является FACT, на формирование альтернативных структур ДНК, а также изучено влияние нуклеосом-связывающих пептидов в качестве ингибиторов FACT. Будут определены механизмы действия противоопухолевых препаратов олапариба и велипариба на структуру и стабильность комплексов PARP1 со структурно различными нуклеосомами. Результаты проекта могут служить в качестве основы для последующей разработки оригинальных технологий персонифицированной диагностики и лечения онкологических заболеваний.

Ожидаемые результаты
В рамках проекта будут определены молекулярные основы функционирования про-опухолевого факторов FACT и PARP1, онкосупрессора p53, архитектурных белков семейства HMGB и линкерных гистонов при эпигенетической регуляции генов в хроматине на уровне нуклеосом и изучены механизмы модуляции активности этих белковых комплексов различными факторами. Взаимодействия FACT, PARP1 и р53 с хроматином будут охарактеризованы как со структурной (влияние на структуру нуклеосом), так и с функциональной (влияние на процесс транскрипции) точек зрения. С использованием современных физико-химических методов (микроскопия одиночных частиц и их комплексов на основе Фёрстеровского резонансого переноса энергии (FRET), анализ электрофоретической подвижности в геле (в том числе с измерением FRET на уровне отдельных молекул), футпринтинг, методы интегративного моделирования, криоэлектронная микроскопия) будут определены механизмы действия факторов FACT, PARP1 и р53 на структуру нуклеосом, в том числе в присутствии вариантов гистонов, регуляторных белков и пост-трансляционных модификаций. Будут определены вклад внутренней подвижности нуклеосом в динамику данных процессов и предпосылки для активации регулируемых этими белками генов на уровне нуклеосом. Будут определены влияния фактора FACT на транскрипцию нуклеосомной ДНК, содержащей различные повреждения ДНК, и роль различных участков гистонов в этом процессе. В проекте будет определен механизм действия противоопухолевых соединений кураксинов, мишенью которых является FACT, на формирование альтернативных структур ДНК в присутствии фактора FACT, а также определено влияние нуклеосом-связывающих пептидов на структуру нуклеосом и на действие фактора FACT. Будут также определены механизмы действия противоопухолевых препаратов олапариба и велипариба, мишенью которых является PARP1, в том числе их влияние на структуру и стабильность комплексов PARP1 со структурно различными нуклеосомами. В ходе решения технических, методических и фундаментальных научных задач по ходу проекта будут существенно усовершенствованы методики микроскопии одиночных частиц и их комплексов на основе FRET для изучения конформационной динамики нуклеосом, а также уточнены динамические модели организации нуклеосом и тетрасом, включая детали внутренней динамики нуклеосом, субнуклеосом (тетрасом и гексасом) и строения линкерной области ДНК. Результаты проекта позволят глубже понять молекулярные механизмы регуляции эпигенетических процессов в хроматине и их роль в развитии патологий, позволят прояснить, как исследуемые в проекте противо- и про-опухолевые факторы вовлечены в эпигенетическую систему регуляции транскрипции хроматина, в том числе и при воздействии противоопухолевых соединений. Результаты проекта могут послужить основой для последующей разработки оригинальных технологий персонифицированной диагностики и контроля лечения онкологических заболеваний.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Методом spFRET-микроскопии в геле получены данные об изменениях в структуре ДНК, сопровождающих связывание белка Nhp6A, и на их основе построены уточненные модели ДНК в свободной и связанной форме. Получены плазмида и штамм-продуцент, обеспечивающие эффективную периплазматическую экспрессию дрожжевого сайт-неспецифического транскприционного фактора Nhp6B в клетках E. coli. Известно, что нуклеосомы динамически диссоциируют, и ре-ассоциируют в функционально значимых участках хроматина. Регулируемое удаление гистонов приводит в образовании суб-нуклеосомных структур — гексасом (при удалении одного димера Н2А-Н2В) и тетрасом (при сохранении только гистонов Н3 и Н4), что может модулировать эффективность процессов транскрипции и репликации ДНК. Методами молекулярной динамики, spFRET-микроскопии и гель-электрофореза исследована структура тетрасом и ее динамика при различной длине ДНК. Установлено, что при удалении димеров H2A-H2B из нуклеосомы структура свободной от контактов с гистонами нуклеосомной ДНК изменяется (“выпрямляется”), приобретая большую динамическую подвижность. В образовавшейся тетрасоме гистоны Н3 и Н4 стабильно взаимодействуют с ДНК, поддерживая ее структуру. Показано, что структура тетрасомы зависит от длины входящей в ее состав ДНК: укладка ДНК на тетрамере гистонов при длине ДНК 78 п.н. похожа на укладку ДНК в нуклеосоме, а при увеличении длины ДНК происходит расхождение концевых фрагментов ДНК в пространстве и возрастание их динамической подвижности. Таким образом, тетрасомы являются динамичными образованиями, структура которых зависит от длины окружающей тетрасому ДНК. Такая пластичность структуры тетрасом в контексте клетки может способствовать эффективному протеканию процессов транскрипции и репликации, при этом связь гистонов Н3 и Н4 с ДНК не теряется. Изучено влияние вариантов и эпигенетических модификаций гистонов Н3.3, H2A.Z и H3K56Q на структуру нуклеосом. Установлено, что вариантные гистоны изменяют укладку нуклеосомной ДНК на октамере гистонов и ее динамику, модулируя стабильность нуклеосом и влияя, вероятно, тем самым на доступность нуклеосомной ДНК для ядерных факторов и на эффективность процессов транскрипции, репликации и репарации ДНК. На примере гистона Н3.3 показано, что вариантные гистоны влияют на способность фермента PARP1 модулировать структуру нуклеосом. Методом spFRET-микроскопии установлено, что линкерный гистон Н1.0, связываясь с нуклеосомой, не только сближает между собой линкерные участки ДНК, но и вносит изменения в структуру нуклеосомной ДНК. Эти структурные изменения происходят по всей длине нуклеосомной ДНК и сопровождаются увеличением расстояния между соседними супервитками ДНК. Установлено, что способность дрожжевого белкового комплекса FACT в присутствии белка Nhp6 к АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом является универсальной и не зависит от вида гистонов, на которых сформированы нуклеосомы. Нуклеосомы, собранные на октамерах гистонов Homo sapiens, реорганизуются дрожжевым FACT в присутствии Nhp6 с образованием асимметричной, почти линейной структуры, такой же, как и в случае нуклеосом, собранных на октамерах гистонов Xenopus laevis. Были наработаны и очищены препараты белков HMO1, HMGB1 и полноразмерного yFACT, а также его мутантных форм, содержащих делеции одного или обоих С-концевых фрагментом субъединиц Spt16 и Pob3. Показано, что взаимодействие HMO1 с FACT, которое способствует АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом, происходит по С-концам субъединиц Spt16 и Pob3, как и в случае гомологичного белка Nhp6. Апробирована методика дизайна пептидов, связывающихся с кислотным лоскутом нуклеосомы, на основе нейросетевого алгоритма ProteinMPNN. Для сгенерированных нейросетью полипептидных последовательностей с помощью нейросетевого алгоритма AlphaFold предсказаны структуры комплексов этих полипептидов с нуклеосомой. Эти структуры позволят провести in silico скрининг предложенных искусственным интеллектом пептидных последовательностей и отобрать наиболее перспективные пептиды для дальнейших исследований. Для измерения констант связывания флуоресцентно-меченых пептидов с нуклеосомами разработан протокол высокоточных измерений на основе анализа поляризации флуоресценции в малых объемах в планшетном формате. Разработаны программы для анализа данных, полученных в ходе измерений, и для определения константы диссоциации изучаемых комплексов. С использованием разработанного протокола определена константа диссоциации комплекса пептида LANA(1-22) с нуклеосомой. Для анализа взаимодействия белков р53 и PARP-1 с нуклеосомами получены флуоресцентно-меченые нуклеосомы, отличающиеся ротационной ориентацией сайта связывания белка p53, расположенного на расстоянии 11 или 16 п.н. от границы нуклеосомы. Методом spFRET-микроскопии охарактеризована конформация линкерной ДНК и ее отличия для этих двух типов нуклеосом. Установлены изменения конформации нуклеосом при различной ротационной ориентации сайта связывания белка p53, и показано, что фермент PARP1 формирует различные комплексы с этими нуклеосомами. Для исследования влияния антираковых препаратов кураксинов на формирование Z-ДНК была создана плазмида, содержащей классическую Z-ДНК-образующую последовательность и разработана экспериментальная система для детекции Z-ДНК в негативно сверхспирализованной плазмидной ДНК. С использованием этой экспериментальной системы было определено, что на сверхспиральной плазмиде pYPCG32 Z-ДНК образуется в ожидаемом положении. Были получены высокочистые активные препараты РНК полимеразы II и фактора транскрипции TFIIS дрожжей. С помощью полимеразной цепной реакции получена матрица для сборки нуклеосом, позволяющая детектировать их положение после транскрипции с помощью рестриктного анализа. Разработан новый, оптимальный протокол флуоресцентного пульс-мечения РНК для анализа РНК-продуктов различной длины, образующихся при транскрипции in vitro. Получены нуклеосомы с однонитевыми разрывами нематричной цепи в положениях +12 и +22 нт от начала нуклеосомы и на них продемонстрирована применимость разработанного метода мечения РНК для изучения остановок РНК полимеразы, индуцируемых разрывом. В ходе экспериментов по транскрипции in vitro определено положение наиболее эффективной ник-индуцированной остановки РНКП при прохождении нуклеосом с разрывом нематричной цепи ДНК после 2 нт от входа в нуклеосому. Методом ПЦР-мутагенеза сконструирована матричная ДНК, позволяющая в ходе транскрипции в условиях ограниченного набора рНТФ получить элонгационный комплекс с РНКП, остановленной в этом положении независимо от наличия разрыва ДНК. С целью совершенствования методик spFRET-микроскопии разработаны протоколы для стандартизации измерений интенсивности флуоресценции от одиночных молекул. Данные протоколы позволяют определить оптимальную мощность возбуждающего излучения для достижения максимального отношения сигнал/фон без значимого фотообесцвечивания флуорофоров. Доработано программное обеспечение для анализа интенсивностей флуоресценции от одиночных молекул с учетом изменений уровня фона и с возможностью удаления артефактных событий. Для изучения локальных изгибов центромерной ДНК пекарских дрожжей методом spFRET-микроскопии сконструированы и получены короткие флуоресцентно-меченые дуплексы ДНК с нуклеотидной последовательностью, которая, как предполагается, не вызывает образования изгиба (ранее были получены аналогичные дуплексы с последовательностью участка центромерной ДНК). Исследования методом spFRET микроскопии показали отсутствие изгиба ДНК в сконструированных «прямых» дуплексах и тем самым дополнительно подтвердили наличие локального изгиба в участке центромерной ДНК пекарских дрожжей, выявленного ранее методом spFRET микроскопии.

Публикации

1. Андреева Т.В., Малюченко Н.В., Ефременко А.В., Любителев А.В., Коровина А.Н., Афонин Д.А., Кирпичников М.П., Студитский В.М., Феофанов А.В. Epigallocatechin Gallate Affects the Structure of Chromatosomes, Nucleosomes and Their Complexes with PARP1 International Journal of Molecular Sciences, V. 24(No. 18), 14187 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms241814187

2. Гупта А., Кумар А., Сингх Н., Пател М., Студитский В.М., Жанг К.И.Дж., Ахтар Мд.С. The Ser7 of RNA Pol II-CTD influences the recruitment of Cdc73 for mRNA transcription International Journal of Biological Macromolecules, Volume 254, Part 2, 127881 (год публикации - 2024) https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.127881

3. Гупта А., Кумар А., Сингх Н., Сударшан Н., Студитский В.М., Жанг К.И.Дж., Ахтар Мд.С. The Saccharomyces cerevisiae SR protein Npl3 interacts with hyperphosphorylated CTD of RNA Polymerase II International Journal of Biological Macromolecules, Volume 253, Part 7, 127541 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.127541

4. Моисеенко А.В. , Егоров А.М., Шайтан К.В., Соколова О.С. Криоэлектронная микроскопия на биологическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова Вестник Московского университета, Серия 16. Биология, Т. 78. № 3S, стр. 51-56 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.55959/MSU0137-0952-16-78-3S-9

5. Олейников П.Д.; Федулова А.С.; Армеев Г.А.; Моторин Н.А.; Сингх-Палчевская Л.; Сивкина А.Л.; Фескин П.Г.; Глухов Г.С.; Афонин Д.А.; Комарова Г.А., Кирпичников М.П., Студитский В.М., Феофанов А.В., Шайтан А.К. Interactions of Nucleosomes with Acidic Patch-Binding Peptides: A Combined Structural Bioinformatics, Molecular Modeling, Fluorescence Polarization, and Single-Molecule FRET Study International Journal of Molecular Sciences, 24,15194 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms242015194

6. Стефанова М.Е., Волох О.И.,Чертков О.В., Армеев Г.А., Шайтан А.К., Феофанов А.В., Кирпичников М.П., Соколова О.С., Студитский В.М. Structure and Dynamics of Compact Dinucleosomes: Analysis by Electron Microscopy and spFRET International Journal of Molecular Sciences, том 24, стр. 12127 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms241512127

7. Ши C., Норденшельд K., Cоколова О.С., Шайтан А.К. Editorial: Recent advances in molecular properties of DNA-protein interactions, chromatin and their biological roles Frontiers in molecular biosciences, V.10,1171714 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3389/fmolb.2023.1171714

8. Бигильдеев А.Е., Алексеев В.И., Грибкова А.К., Тимохин Г.С., Комарова Г.А., Шайтан А.К. Роль изменений в структуре и динамике хроматина при COVID-19 Генетика, - (год публикации - 2024)

9. Шайтан К.В. Как биополимер (белок) сворачивается в уникальную 3D- структуру? ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ, 3S, 78, 9-12. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.55959/MSU0137-0952-16-78-3S-2

10. Волох О., Назарова А., Афонин Д., Студитский В.М., Соколова О.С. STRUCTURAL FEATURES OF SUBNUCLEOSOME REORGANIZATION BY YEAST CHAPERONE FACT Riccem2023 book of abstracts, стр 15-16 (год публикации - 2023)

11. Кошкина Д., Малюченко Н., Любителев А., Феофанов А., Студитский В. Comparison of the effect of linker histones H1.0 and H1.5 on the structure of the linker region of nucleosomes Riccem2023 book of abstracts, стр.11 (год публикации - 2023)

12. Фескин П.Г., Мамаева Н.У., Шайтан А.К. Analyzing DNA-protein complexes’ stability using fluorescence polarization to facilitate sample preparation for electron microscopy Riccem2023 book of abstracts, стр.18 (год публикации - 2023)