КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-74-30007

НазваниеРазработка новых фармакологических мишеней и взаимодействующих с ними низкомолекулярных химических соединений для лечения болезни Альцгеймера

РуководительМакаров Александр Александрович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2023 г. - 2025 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (33).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаБолезнь Альцгеймера, бета-амилоид, церебральный амилоидоз, нейродегенерация, молекулярный механизм патогенеза, белок-белковые взаимодействия, компьютерное моделирование, ионы металлов, пост-трансляционные модификации, амилоидные матрицы, трансгенные животные, аутопсийный материал, фармакологические мишени, ингибиторы агрегации, прототипы лекарственных средств

Код ГРНТИ34.15.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Болезнь Альцгеймера (БА) является одной из острейших проблем здравоохранения во всём мире. Несмотря на то, что до сих пор не существует эффективных болезнь-модифицирующих средств для терапии БА, проводится широкомасштабный поиск таких средств, в основном в рамках подхода трансляционной медицины. Клинические исследования показали, что олигомеризация Aβ представляется первичным процессом, запускающим патологический каскад БА. В связи с этим именно Aβ (включая олигомеры и агрегаты Aβ), а также нейровоспалительные процессы, ассоциированные с аномальными накоплениями Aβ, считаются наиболее актуальными лекарственными мишенями для разработок терапевтических стратегий при патогенезе БА. Однако Aβ является жизненно необходимым компонентом биологических жидкостей человека, поэтому сам по себе Aβ не подходит на роль непосредственной лекарственной мишени. Научная новизна проекта состоит в использовании нековалентных комплексов Aβ, содержащего изомеризованный аминокислотный остаток D7 (isoD7-Aβ), с ионами цинка в качестве лекарственной мишени нового типа, направленное воздействие на которую предотвращает развитие патогенной агрегации эндогенного Aβ и ассоциированные с ней нейровоспалительные процессы. Проект основывается на результатах, полученных авторами при выполнении Проекта 2019. Данные о молекулярных механизмах взаимодействий изоформ Aβ с ионами цинка привели к установлению критической роли isoD7-Aβ в зарождении и распространении цитотоксических олигомеров эндогенного Aβ. Сравнительный анализ структурно-функциональных свойств изоформ Aβ позволил выявить молекулярные детерминанты, воздействие на которые посредством рационально сконструированных агентов позволяет контролировать взаимодействия Aβ с белками-партнерами и, как следствие, блокировать развитие патологических состояний, ассоциированных с такими взаимодействиями. Целью настоящего проекта является разработка терапевтических средств различной природы для направленного ингибирования образования нековалентных цинк-зависимых комплексов природных изоформ Aβ, а также выявление молекулярных механизмов биологического действия таких комплексов в норме и при патологии БА. Для достижения заявленной цели планируется использовать как различные экспериментальные системы in vitro и клеточные модели, так и широкий спектр моделей БА in vivo, который включает: (1) ооциты с оверэкспрессией белков-партнёров Aβ; (2) трансгенные нематоды; (3) трансгенные мыши с оверэкспрессией человеческого Aβ; (4) трансгенные мыши с редактированным геномом, у которых с помощью технологии CRISPR/Cas сайт 35-HAEE-38 субъединицы α4 никотинового ацетилхолинового рецептора α4β2 был заменен на 35-HAAA-38 с целью предотвращения взаимодействия Aβ с рецептором. Во-первых, будут выявлены основные характеристики воздействия isoD7-Aβ (как в свободном, так и в связанном с ионами цинка состояниях) на агрегацию нативных молекул Aβ в условиях модельных систем, а также определена эффективность подавления такого воздействия с помощью молекулярных агентов, специфически взаимодействующих с isoD7-Aβ в комплексе с цинком. Во-вторых, будет проведен сравнительный анализ эффектов Aβ и isoD7-Aβ на патогенную активацию иммунной системы как в отсутствии, так и в присутствии специфических ингибиторов цинк-зависимой олигомеризации Aβ. В-третьих, будет охарактеризовано воздействие специфических лигандов Na,K-АТФазы на возможность блокирования противовоспалительного ответа микроглии и нарушения функционирования нейрональных клеток, вызванных молекулами isoD7-Aβ. В-четвёртых, будет установлена способность isoD7-Aβ выступать в качестве индуктора защитного иммунного ответа против развития БА. В результате выполнения проекта будут разработаны молекулярные агенты для направленного подавления патогенных эффектов, вызываемых свободными и/или цинк-связанными молекулами isoD7-Aβ, при развитии БА. Такие агенты будут востребованы в качестве кандидатных средств для болезнь-модифицирующей терапии БА.

Ожидаемые результаты
Выполнение проекта впервые позволит реализовать стратегию использования нековалентных комплексов isoD7-Aβ с ионами цинка в качестве лекарственной мишени, направленное воздействие на которую предотвращает развитие патологических процессов, ассоциированных с БА. В ходе выполнения проекта планируется получить следующие основные результаты. Будут сконструированы ингибиторы образования зародышей агрегации эндогенного Aβ при БА. Эффективность действия таких ингибиторов будет проверена in silico, in vitro и in vivo. Одной из центральных лекарственных мишеней для этих ингибиторов являются аберрантные взаимодействия комплексов isoD7-Aβ и ионов цинка с никотиновым ацетилхолиновым рецептором α4β2 (α4β2-nAChR). Для целенаправленного блокирования таких взаимодействий будут использованы оригинальные пептиды и пептидомиметики с высоким сродством к участку 11-EVHH-14 Aβ, который обладает конформационной жёсткостью и опосредует все известные цинк-зависимые взаимодействия Aβ с другими биомолекулами. Роль участка НАЕЕ α4 субъединицы рецептора α4β2-nAChR в качестве центра патологической агрегации Аβ в тканях мозга будет доказана с использованием линии мышей, созданной в рамках Проекта 2019, у которых с помощью технологии генетического редактирования CRISPR/Cas в сайте 35-HAEE-38 α4β2-nAChR остатки глутаминовой кислоты были заменены на остатки аланина (35-HAAA-38) с целью предотвращения взаимодействия Aβ с рецептором α4β2-nAChR. С помощью трансгенных животных и клеточных моделей будет определена сравнительная эффективность избирательного (с помощью ингибиторов) и тотального подавления образования центров патологической агрегации Aβ на рецепторах. Будет выявлена роль изоформ Aβ в патогенной активации клеток иммунной системы и определены способы ее подавления. Для этого будет оценено провоспалительное действие Aβ и isoD7-Aβ на клетки микроглии и нейрональные клетки мыши и возможности его ингибирования с помощью антиамилоидных агентов. Будет сопоставлено действие Аβ и isoD7-Аβ на электрофизиологическую активность мозга животных и их поведение и установлена способность ингибиторов предотвращать нарушения, вызванные амилоидными пептидами. Будет оценена возможность применения кардиотонических стероидов для предотвращения патогенных эффектов бета-амилоидных пептидов, вызванных их связыванием с Na,K-АТФазой, на микроглиальные и нейрональные клетки. Будет определено защитное действие активной иммунизации изомеризованной формой Aβ на прогрессию БА в мышиных моделях. Для этого животные будут иммунизированы фрагментом isoD7-Aβ. После иммунизации в мышах будет охарактеризован гуморальный иммунный ответ к амилоидным пептидам и оценена его специфичность к isoD7-Aβ. Затем будет оценено влияние активной иммунизации на поведение и развитие церебрального амилоидоза у животных, что позволит определить эффективность использования антигена фрагмента isoD7-Aβ как мишени для активации гуморального иммунного ответа, позволяющего предотвратить развитие БА. В результате выполнения проекта будет значительно расширена и валидирована на животных моделях БА линейка прототипов средств лечения болезни Альцгеймера, концепция создания которых была разработана в Проекте 2019, на основе пептидов и пептидомиметиков, направленно подавляющих патогенные эффекты, вызываемые isoD7-Aβ в комплексе с цинком, при развитии БА. Наиболее эффективные прототипы лекарственных средств будут переданы/лицензированы фармацевтической компании АО «Генериум» для проведения необходимых доклинических и клинических испытаний и вывода их на рынок. Главным ожидаемым конкурентным преимуществом таких средств будет их высокая эффективность. Это обусловлено тем, что в отличие от используемых в настоящее время кандидатных антиамилоидных препаратов (например, моноклонального антитела BAN2401), такие средства будут действовать в качестве высокоспецифических агентов для подавления патологических процессов при развитии БА, но не будут затрагивать нормальную физиологическую функцию эндогенного бета-амилоида. Внедрение результатов проекта в клиническую практику будет осуществляться на базе профильной медицинской организации Российский геронтологический научно-клинической центр ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ. Создание в рамках настоящего проекта прототипов болезнь-модифицирующих лекарственных средств, основанных на рациональном использовании молекулярного механизма направленного подавления патологических эффектов бета-амилоидных пептидов, соответствует новейшим мировым тенденциям в развитии и практическом использовании фундаментальных подходов для эффективной терапии БА. В настоящее время не существует эффективных средств лечения болезни Альцгеймера, и получение таких препаратов позволит снизить финансовое бремя на лечение и содержание больных и значительно повысить их социальную адаптацию. Таким образом, ожидаемые результаты выполнения проекта соответствуют мировому уровню исследований в данной области и направлены на практическое применение в здравоохранении и повышение качества жизни людей.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Результаты наших предыдущих исследований позволили установить роль изомеризованного по Asp7 бета-амилоида (isoD7-Aβ) в качестве молекулярного агента, оказывающего критическое влияние на различные аспекты патогенеза болезни Альцгеймера, включая инициирование агрегации эндогенных молекул бета-амилоида (Aβ) и активацию воспалительных процессов. Более того, было установлено, что участок 11-EVHH-14 является цинк-зависимой структурно-функциональной детерминантой не только isoD7-Aβ, но и всех других известных изоформ Aβ. Именно этот участок Aβ находится в составе межмолекулярных интерфейсов при взаимодействии природных изоформ Aβ с рядом как цитозольных, так и мембраносвязанных белков. Соответственно, выяснение молекулярных механизмов, посредством которых isoD7-Aβ вовлечён в развитие патологических процессов при болезни Альцгеймера, а также определение средств эффективного ингибирования таких механизмов представляет собой приоритетные задачи Проекта. Ранее нами было установлено, что участок 11-EVHH-14 пептида Aβ является ион-комплементарным по отношению к участку 35-НАЕЕ-38 субъединицы α4 никотинового ацетилхолинового рецептора подтипа α4β2 (α4β2nAChR). На модельных клеточных культурах было определено, что зародышевыми центрами нейротоксических амилоидных агрегатов являются нековалентные комплексы Aβ с α4β2nAChR, а синтетический пептид HAEE эффективно разрушает модельные амилоидные агрегаты за счет конкурентного взаимодействия с молекулами Aβ в межмолекулярном интерфейсе, образованными участками 11-EVHH-14 и 35-НАЕЕ-38 пептида Aβ и рецептора α4β2nAChR, соответственно. Для проверки роли участка 35-HAEE-38 субъединицы α4 рецептора α4β2nAChR в связывании с Aβ был проведен сайт-направленный мутагенез α4 субъединицы в предполагаемом сайте связывания для замены аминокислот в данном области на остатки аланина и получен ряд мутантов (35-AAAA-38, 35-AAAE-38, 35-AAEE-38, 35-HAAE-38, 35-НААА-38). Функциональный анализ взаимодействий Aβ с рецептором α4β2nAСhR дикого типа и его мутантов был проведён путем электрофизиологического анализа ответов рецепторов, экспрессированных в ооцитах Xenopus laevis, на аппликацию ацетилхолина методом двухэлектродной фиксации потенциала. Было установлено, что после преинкубации с Aβ средняя амплитуда ответа в рецепторе дикого типа была снижена на ~ 30%. В то же время, преинкубация мутантных рецепторов 35-AAAA-38, 35-AAAE-38, 35-AAEE-38, 35-HAAE-38, 35-НААА3-8 с Aβ вызывала снижение тока на ~10,8%, 20%, 20,3%, 23%, 12% и, таким образом, данные рецепторы за счёт соответствующих мутаций были более защищены от ингибирующего воздействия Aβ, чем нативный рецептор. Полученные с использованием ооцитов в качестве модельной клеточной системы результаты свидетельствуют о потенциально значимой роли участка 35-38 рецептора α4β2nAChR во взаимодействии с Aβ. Чтобы валидировать роль участка 35-НАЕЕ-38 рецептора α4β2nAChR в модулировании прогрессии болезни Альцгеймера in vivo, методами генной инженерии были созданы линии трансгенных мышей (NAP и Nahr), в которых последовательность 35-НАЕЕ-38 изменена на 35-НAAA-38, чтобы разрушить ион-комплементарный интерфейс EVHH/HAEE между Aβ и α4β2nAChR и, таким образом, остановить образование амилоидных бляшек в тканях мозга и уменьшить психосоматический и когнитивный дефициты у трансгенных мышей линии APP/PS1, оверэкспрессирующих человеческий Aβ. У мышей линии Nahr имеется только замена HAEE>HAAA, в то время как мыши линии NAP помимо замены HAEE>HAAA обладают генотипом APP/PS1. Влияние модификации [HAEE-HAAA]-α4β2nAChR на когнитивные функции и формирование памяти 10-месячных животных исследовали последовательно в батарее тестов «Открытое поле», «Распознавания нового объекта», «Тёмно-светлая камера», «Резидент – интрудер», «Лабиринт Барнса». Проведенные тесты показали снижение агрессии, восстановление кратковременной памяти и способности к обучению экспериментальных животных с заменой [HAEE-HAAA]-α4β2nAChR. На основе полученных данных можно сделать вывод о защитном влиянии данной замены на развитие нейродегенерации по типу болезни Альцгеймера. Таким образом, впервые в экспериментах in vivo подтверждена критическая роль межмолекулярного интерфейса EVHH/HAEE между Aβ и α4β2nAChR в патогенезе болезни Альцгеймера. Нами установлено, что синтетический тетрапептид НАЕЕ способен обращать вспять негативные проявления болезни Альцгеймера в животных моделях (трансгенные мыши, трансгенные нематоды) за счет специфического связывания с агрегированными молекулами Aβ и последующего разрушения нейротоксических агрегатов Aβ, в том числе ассоциированных с рецепторами α4β2nAChR. Поэтому пептид HAEE был использован нами в качестве прототипа для создания новых ингибиторов агрегации Aβ, которые по сравнению с HAEE обладали бы более высоким сродством к Aβ и были бы более стабильными в биологических средах. С помощью компьютерного моделирования и физико-химических методов проанализирована in silico и in vitro способность данных молекулярных агентов формировать стабильные специфические комплексы с изоформами Aβ (Aβ(1-42), isoD7-Aβ(1-42)) и с рецептором α4β2nAChR как в отсутствии, так и в присутствии ионов цинка. Установлено, что как Aβ(1-42), так и isoD7-Aβ(1-42) вызывают увеличение продукции клетками микроглии провоспалительных цитокинов, таких как TNFα и IL-6. При этом isoD7-Aβ(1-42) индуцирует провоспалительный ответ микроглии в 100 раз меньшей концентрации, чем Aβ(1-42), что указывает на более сильное провоспалительное действие isoD7-Aβ(1-42). Показано, что Aβ(1-42) значительно изменяет редокс-статус клеток микроглии и при этом наблюдается повышение уровня АФК, GSH, митохондриального потенциала, гранулярности клеток и количества клеток с поврежденной мембраной. Напротив, isoD7-Aβ(1-42) не изменяет редокс-статус клеток микроглии, что свидетельствует о различных механизмах действия данных изоформ Aβ на клетки микроглии. Потенциально патогенные эффекты isoD7-Aβ(1-42) могут быть подавлены с помощью специфических антител, для получения которых нами разработан метод иммунизации мышей, вызывающий хорошо детектируемый В клеточный и антительный ответ к участку isoD7-Aβ. Обнаружено, что инкубация нейрональных клеток, полученных путем дифференцировки клеток линии SH-SY5Y, c Aβ(1-42) и isoD7-Aβ(1-42) приводит к активации Src-киназы и возрастанию уровня белка-предшественника бета-амилоида (APP). Это возрастание предотвращается добавлением ингибитора Src-киназы, что подтверждает ее участие в изменении уровня АPP под действием изоформ Aβ. Полученные данные свидетельствуют о существовании положительной петли обратной связи, увеличивающей количество образующегося Aβ и важны для понимания процессов, лежащих в основе физиологического и патогенного действия изоформ Aβ. Выявлено, что кардиотонические стероиды (КТС) способны модулировать действие изоформ Aβ как на активацию Src-киназы, так и на уровень АPP. Установлено, что дигоксин представляет собой КТС, который наиболее эффективно предотвращает активацию Src-киназы и возрастание АPP. Также показано, что дигоксин способен подавлять связывание изоформ Aβ с с Na,K-АТФазой и значительно снижает провоспалительную активацию клеток микроглии под действием изоформ Aβ, приводя к снижению повышенных уровней АФК и GSH до контрольных значений. Эти данные позволяют рассматривать использование дигоксин для снижения нейровоспаления при болезни Альцгеймера.

Публикации

1. Василенко Е.О., Козин С.А., Митькевич В.А. Бучельников А.С., Нечипуренко Ю.Д. Термодинамическая модель образования линейных белковых агрегатов на матрице Биофизика, - (год публикации - 2024)

2. Петрушанко И.Ю., Митькевич В.А., Макаров А.А. Effect of β‑amyloid on blood‑brain barrier properties and function Biophysical Reviews, 15, 183–197 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s12551-023-01052-x