Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Одной из основной задач проекта является исследование роли архитектурных белков в организации регуляторных элементов, прежде всего промоторов и инсуляторов. Согласно модели, к архитектурным белкам относятся транскрипционные факторы, содержащие кластеры цинковых пальцев С2Н2-типа (С2Н2-белки), которые связываются с длинными 12-18 п.н. мотивами. Различные комбинации мотивов С2Н2-белков определяют свойства регуляторных элементов, прежде всего инсуляторов и промоторов. Партнером большой группы С2Н2-белков является СР190, который связывается со значительной частью промоторов генов дрозофилы, преимущественно представляющих собой гены «домашнего хозяйства». Основной функцией СР190 является привлечение совместно с белками Z4 и Chro транскрипционных комплексов, стимулирующих активность промоторов. Наиболее известные архитектурные белки, найденные исходно в составе инсуляторов, такие как Pita, dCTCF и Su(Hw), связываются с ВТВ-доменом СР190. За отчетный период показано, что M1BP, Opbp и ZIPIC, связывающиеся преимущественно с промоторами генов «домашнего хозяйства», взаимодействуют с 210–245 а.о. и 309–390 а.о. районами СР190. Делеция 210–245 а.о., 309–390 а.о или замена ВТВ-домена на аналогичный домен белка человека Kaiso приводит к значительному снижению функциональной активности СР190, что связано с уменьшением эффективности его рекрутирования на геномные сайты. Согласно модели, с каждым регуляторным элементом связывается несколько архитектурных белков, которые совместно рекрутируют транскрипционные комплексы и в том числе СР190. Действительно, в трансгенных линиях, которые экспрессируют мутантные варианты белков dCTCF, Su(Hw), Pita или CG31365, неспособные взаимодействовать с СР190, не наблюдаются значительные изменения в связывании СР190 с регуляторными элементами. В результате проведенных исследований было показано, что снижение эффективности связывания СР190 и снижение экспрессии генов прямо коррелирует с присутствием одновременно двух или трех мотивов в промоторах генов для мутантных архитектурных белков, не способных взаимодействовать с СР190. Был описан новый архитектурный белок Mzfp1, характерной особенностью которого является способность специфично связываться с 15 п.н. мотивом в промоторах как эухроматиновых, так и гетерохроматиновых генов. Один из двух MADF-доменов в составе Mzfp1 является необходимым для эффективного рекрутирования этого архитектурного белка в гетерохроматиновые области. Было показано, что Mzfp1 активирует большую группу генов «домашнего хозяйства», но является наиболее важным для активности 20 промоторов, которые находятся в гетерохроматине. Гены, кодирующие архитектурные С2Н2-белки, являются самой эволюционно быстро изменяющейся и распространяющейся группой у дрозофилы и млекопитающих. Можно предположить, что в результате активной дупликации и распространения архитектурных C2H2-белков повышается стабильность функционирования регуляторных элементов, состоящих из энхансеров и промоторов. В качестве модели для исследования механизмов дивергенции С2Н2-белков были выбраны гены, кодирующие белки M1BP и Ranshi. Оба белка содержат N-концевой ZAD-домен, соединенный нестуктурированным линкером с C-концевым кластером, состоящим из 5 С2Н2-доменов. M1BP является ключевым архитектурным белком, который связывается с более чем 2000 промоторами, и даже незначительное снижение экспрессии этого белка приводит к летальности. Ген, кодирующий Ranshi, который у Drosophila melanogaster не имеет важных функций, возник недавно в процессе эволюции дрозофилы в результате дупликации гена m1bp. Нами получены предварительные результаты, согласно которым специфичность связывания Ranshi и M1BP во многом определяется неструктурированными последовательностями линкера, который соединяет ZAD-домен и C2Н2-кластеры в белках. Для прямой демонстрации организации СР190-зависимых промоторов генов «домашнего хозяйства» из комбинаций мотивов связывания для архитектурных С2Н2-белков в проекте проводится идентификация мотивов связывания для всех найденных в настоящее время архитектурных белков, которые взаимодействуют с СР190. За отчетный период было продолжено описание мотивов и картирование сайтов связывания белков CG4820, CG6808, CG6654, CG15073, CG6254, CG4730, CG30020, CG2116 и CG2712 на регуляторных элементах. Согласно текущей модели, ключевую роль в активности архитектурных белков играют N-концевые гомодимеризующиеся домены, которые участвуют в поддержании специфичных дистанционных взаимодействий и эффективном рекрутировании архитектурных белков на хроматин. У большой группы архитектурных белков, включая Pita и CG31365 имеется ZAD-домены, которые преимущество формируют гомодимеры. У других архитектурных белков, таких как CTCF и ZNF143 у человека, CTCF и CLAMP у дрозофилы, были найдены N-концевые неструктурированные домены, способные к гомодимеризации (НДД). Было показано, что НДД у СTCF дрозофилы является необходимым для эффективного рекрутирования этого архитектурного белка на регуляторные элементы. Несмотря на отсутствие гомологии, НДД из белка CTCF человека может эффективно работать в химерном белке dCTCF, что предполагает эволюционную консервативность функции. Мы полагаем, что архитектурные С2Н2-белки, не связанные с хроматином, находятся в ядерных тельцах/спеклах, в формировании которых играют ключевую роль CP190 и изоформы белка Mod(mdg4). Считается, что архитектурные и сопутствующие белки в результате множественных белок-белковых взаимодействий формируют фазу, которая объединяет несвязанные с хроматином белки и блокирует их ДНК-связывающую активность. Во многих случаях сумоилирование белков, способность SUMO к гомодимеризации/мультимеризации, и связывания SUMO c SIM-сайтами белков значительно увеличивают эффективность формирования ядерных телец. Отдельной задачей проекта является исследование белка Kaiso человека, который обычно работает как репрессор транскрипции. Kaiso имеет на N-конце ВТВ-домен, центрально расположенный кластер, состоящий из трех С2Н2-доменов. С2Н2-домены совместно с С-концевым доменом (размером 31 а.о.) отвечают за специфичное связывания Kaiso с ДНК-мотивами. С-концевая область принимает упорядоченную структуру только после связывания Kaiso к ДНК. Kaiso имеет два консервативных пролина в положении Р588 (31 а.о. домен) и в линкере (Р577) между С-концевым доменом и С2Н2-кластером. Пролин может находиться в цис- и транс- конформации, что влияет на структурную организацию доменов белка. Существует особый класс пептидил-пролил изомераз, которые усиливают переход из транс- в цис- конформацию пролина в составе белка. Предполагается, что пролины в Kaiso могут участвовать в регуляции связывания белка с хроматином и взаимодействия с белками-партнерами, например, как катенин р120. С целью исследования этого вопроса были созданы клеточные линии рака почки человека Caki1, которые экспрессировали только определенные варианты белка Kaiso. Белок Kaiso и мутантный вариант Kaiso(P577A) локализуются преимущественно в ядре. Мутантный белок Kaiso(P588A) хуже связывается с хроматином и частично перераспределяется в цитоплазму. Мутантные варианты Kaiso также появляются в ядерных спеклах. Мутации в пролинах не нарушают взаимодействия Kaiso c катенином р120 в клетках Caki1. Было показано, что Kaiso взаимодействует с белком TRIM28, который привлекает репрессионные комплексы на хроматин. При сильной экспрессии в клеточных линиях Kaiso выступает в роли Е3-SUMO лигазы для TRIM28 и приводит к его гиперсумоилированию. Мутация по лизину 42 (сайт сумоилирования) в ВТВ-домене и инактивация всех SIM-сайтов (мотивы, которые взаимодействуют с SUMO) в белке Kaiso не влияет на способность Kaiso участвовать в гиперсумоилировании TRIM28. Мутантный вариант Кaiso, содержащий одновременно K42R и делецию SIMов 2-5, входит в состав ядерных телец более эффективно, что предполагает отсутствие роли SIMов в интеграции Kaiso в ядерные тельца. Таким образом, SUMO не является определяющим для вхождения Kaiso в ядерные тельца.