Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Витамин В12 – незаменимый микронутриент, дефицит которого усугубляет последствия, в том числе, старения, воспаления и сенесенса. В настоящее время дефицит витамина может диагностироваться по недостаточной концентрации в крови. При этом не существует работающих подходов для измерения витамина В12 в культурах клеток человека. Данный проект направлен создание генетически кодируемого молекулярного инструмента, который мог бы позволить измерения внутриклеточных изменений в концентрации витамина В12. Для решения задачи мы выбрали витамин В12-связывающие белки из бактерий. Мы выбирали бактериальные белки, потому что бактерии являются ортогональной системой для млекопитающих, поэтому исключается потенциальные побочные эффекты при использовании молекулярного инструмента, например, вмешательство в сигнальные пути или нежелательная регуляция клеточных процессов или самого сенсора. Нами были получены 3 термофильных микроорганизма Thermogladius calderae, Fervidobacterium riparium strain 1445, Fervidicoccus fontis, которые обитают на территории России. С помощью стандартных молекулярно-биологических методов нами были получены кодирующие последовательности белков из локусов AFK51173 для T. calderae и UXF00406.1 для F. riparium, а также ген btuF из E. coli в качестве запасного варианта. Мы разработали протокол для очистки белков в аналитических масштабах при помощи металл-хелатной хроматографии и последующей ультрафильтрации. Белок AFK51173 из T. calderae в бактериальной системе экспрессии экспрессируется в нерастворимом виде, вероятнее всего, из-за редких кодонов ДНК в геномной последовательности. Из-за необходимости трудоемкого и дорогого синтеза не охарактеризованного белка из нуклеотидов от него было принято решение отказаться. Полученные белки UXF00406.1 из F. riparium и btuF из E. coli были протестированы в аналитических масштабах для определения связывания с витамином В12 с помощью собственных и опубликованных методик. Одна из опубликованных методик была экспериментально опровергнута. Согласно двум другим методикам, btuF из E.Coli связывает витамин В12 лучше, чем белок UXF00406.1 из F. riparium. Поэтому было принято решение использовать btuF E. coli, который является периплазматическим компонентом белкового комплекса для импорта витамина В12 в цитоплазму E. coli. Далее мы использовали две стратегии для гарантированного получения сенсора витамина В12. Первая основана на получении библиотек, в которых в нуклеотидную последовательность btuF случайным образом вставляется нуклеотидная последовательность флуоресцентного белка. Далее бактерии, которые за счёт генотипа одинаковым уровнем экспрессии белка, экспрессируют слитые белки, и бактерии сортируются по величине отклика на витамин В12. Мы получили данные библиотеки и разработали протокол для сортировки бактерий. Для получения библиотек мы использовали in vitro транспозазную реакцию с использованием варианта Mu транспозазы. В плазмиды, содержащую ген btuF были вставлены транспозоны с экспрессионной кассетой, содержащей устойчивость к антибиотику хлорамфениколу. Гены со вставкой-транспозоном были вырезаны по целевому размеру и клонированы в плазмиду для экспрессии. В этих плазмидах транспозон был заменен на последовательности зеленого и красного флуоресцентного белков, флуоресцентного домена сенсора цАМФ G-Flamp2 и полученного нами варианта белка mScarlet3 с круговой перестановкой N- и C-концов, соответственно. Далее мы отработали протокол сортировки бактерий, который будут экспрессировать данные библиотеки для отбора лучших вариантов сенсора. Вторая стратегия основана на применении рационального дизайна. Мы выбрали подход с использованием Фёрстеровского переноса энергии (Förster resonance energy transfer, FRET). При FRET необходимо перекрытие спектра эмиссии донора энергии и спектра возбуждения акцептора энергии. Нами были получены варианты зеленого и красного флуоресцентных белков самой перспективной на настоящее время FRET пары. С помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами мы получили генетическую конструкцию, в которой присутствует донор энергии mClover3, витамин В12-связывающий белок btuF из E. Coli, акцептор энергии mScarlet3. Этот сенсор был проверен в культуре клеток млекопитающих. При добавлении витамина В12 уровень FRET изменяется, т.е. сенсор чувствителен к изменению концентрации витамина В12. В связи с недоступностью гена для опубликованного сенсора витамина В12 SenVital, мы синтезировали ген самостоятельно. Для этого мы получили гены варианты голубого и жёлтого флуоресцентного белков CFP и YFP и ген btuF из E. Coli, которые используются в оригинальной конструкции. Конструкцию получили с помощью метода Golden Gate. Была проведена подготовка к измерениям в живых клетках млекопитающих. Для этого мы собрали коллекцию опубликованных биосенсоров и протестировали их работу в клетках млекопитающих. Коллекция включает в себя генетически кодируемые биосенсоры SoNar (NAD+/NADH), SypHer (внутриклеточный рН), метилирования лизина в гистоне 3 (H3K9me).