КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-75-30007

НазваниеФундаментальные проблемы регенеративной медицины: регуляция обновления и репарации тканей человека

РуководительТкачук Всеволод Арсеньевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2023 г. - 2025 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (33).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-405 - Регенеративная медицина

Ключевые словаОбновление тканей; репарация; регенерация; микроокружение стволовой клетки; мезенхимные стволовые клетки; нейроэндокринная регуляция стволовых клеток; механизмы формирования и поддержания гетерогенности клеток в тканях; эпителиально-мезенхимальный переход; регенеративная медицина

Код ГРНТИ76.03.31

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В ходе исследований, выполненных по Проекту 2019 года, нами раскрыты механизмы, лежащие в основе процессов обновления ниши стволовых клеток, гетерогенности стволовых клеток в составе такой ниши и способности этих клеток к направленной дифференцировке, предотвращению развития фиброза (замещения функциональных специализированных клеток внеклеточным матриксом), регуляции направленного роста кровеносных сосудов и нервных волокон, что поддерживает как обновление клеток, так и регенерацию/ репарацию органов и тканей. Полученные нами данные обосновывают целесообразность продолжения исследований, направленных на раскрытие этих механизмов, что позволит вести направленный поиск эндогенных регуляторов, влияющих на продолжительность и эффективность работы органов и тканей. В Проекте-2023 с помощью уже отработанных подходов и принципиально новых моделей будут решены новые задачи, включая анализ влияния норадреналина, серотонина, инсулина и паратиреоидного гормона на самоподдержание МСК, а также коммитирование и терминальную дифференцировку этих клеток в адипогенном и остеогенном направлениях. Ключевой задачей Проекта-2023 станет исследование механизмов участия МСК в формировании микроокружения тканеспецифичных стволовых клеток и регуляции их активности. Для этого нами будут использованы in vivo модели формирования микроокружения стволовых и прогениторных клеток базального слоя эндометрия; повреждения ниши сперматогониальной стволовой клетки, а также модель старения микрососудистого эндотелия, вызванного хроническим введением ангиотензина. Поскольку старение не только нарушает способность МСК поддерживать микроокружение стволовых клеток, но и вызывает изменение их чувствительности к гормонам, в задачи Проекта-2023 входит исследование механизмов развития инсулинорезистентности МСК при старении. В данном проекте будут установлен профиль микроРНК в секретоме сенесцентных МСК. Их вклад в подавление чувствительности клеток к инсулину будет проверен при помощи молекулярно-биологических и биохимических методов с использованием ингибиторного анализа. Идентификация механизмов регуляции инсулин-зависимой внутриклеточной сигнализации в процессах самообновления и дифференцировки МСК позволит выявить ключевые точки возникновения нарушений регенерации ткани и предложить варианты терапевтического воздействия на них.Наши данные, как и публикации мирового уровня других авторов, указывают на то, что именно активность МСК может определять исход ответа ткани на повреждение – формирование и прогрессию фиброза, либо, напротив, разрешение фиброза и восстановление структурно-функциональной целостности ткани. В рамках Проекта-2023 будет проанализирована паракринная активность описанных нами в рамках Проекта-2019 субпопуляций МСК. Нами уже установлены белки и микроРНК, которые могут опосредовать анти- и профибротическое действие МСК. В предлагаемом проекте мы проанализируем их представленность в секретомах отдельных субпопуляций МСК, выясним их вклад в течение процессов фиброза на моделях in vitro и in vivo. Решение задач Проекта-2023 обеспечит значительный прогресс в понимании механизмов участия гормонов и нейромедиаторов в регуляции обновления клеточного состава тканей человека, роли МСК в репарации тканей. Будут обнаружены новые механизмы регуляции активности стволовых клеток, найдены новые способы предотвращения фиброза тканей. Мы ожидаем, что результаты Проекта-2023 будут в значительной мере способствовать созданию препаратов, которые будут увеличивать не только среднюю «популяционную», но и индивидуальную продолжительность жизни человека.

Ожидаемые результаты
В Проекте-2023 будут получены принципиально новые актуальные результаты, которые расширяют существующие представления о механизмах участия МСК в обновлении и репарации тканей. В рамках исследования влияния гормонов и нейромедиаторов на самообновление и дифференцировку МСК с помощью глубокого биоинформатического анализа массивов данных транскриптомов одиночных клеток в результате выполнения Проекта-2023 будут выяснены транскрипционные механизмы выбора направления дифференцировки этими клетками. С помощью расчета регулонов – комплексов транскрипционных факторов и их мишеней, будут выявлены факторы транскрипции, которые активируются в процессе дифференцировки МСК в запасающие и термогенные адипоциты, остеоциты, фибробласты и ГМК-подобные клетки. Влияние гормонов на выбор направления дифференцировки МСК будет подтвержден in vivo на модели трансгенных мышей, содержащих кассету редактирования генома CARLIN (модификация CRISPR/Cas9). В результате выполнения данного проекта будет проанализированы механизмы влияния инсулина на адипоцитарную дифференцировку МСК. В частности, будет исследовано переключение эффекторных сигнальных каскадов инсулинового рецептора, происходящих при развитии инсулинорезистентности. Нами будет оценен вклад “нетипичной” инсулин-зависимой кальциевой сигнализации в формировании инсулинорезистентного фенотипа этих клеток. Причиной развития инсулинорезистентности может также быть изменение секреции микроРНК стареющими МСК. В результате выполнения данного проекта будут описан профиль микроРНК в секретоме сенесцентных МСК. Их вклад в подавление чувствительности клеток к инсулину будет оценен при помощи молекулярно-биологических и биохимических методов с использованием ингибиторного анализа. Идентификация механизмов регуляции инсулин-зависимой внутриклеточной сигнализации в процессах самообновления и дифференцировки МСК позволит выявить ключевые точки возникновения нарушений регенерации ткани и предложить варианты терапевтического воздействия на них. В результате выполнения Проекта-2023 будут верифицированы выявленные мишени, воздействуя на которые можно регулировать чувствительность МСК к паратиреоидному гормону. Эти результаты могут быть использованы в дальнейшем для разработки подходов для терапевтической регуляции остеогенной дифференцировки этих клеток. В результате выполнения Проекта-2023 будут получены новые данные об участии МСК в формировании микроокружения тканеспецифичных стволовых клеток и регуляции их активности. Ранее мы впервые описали МСК в нише сперматогониальной стволовой клетки (ССК) и показали, что паракринная активность МСК необходима для поддержания ССК. В результате выполнения данного проекта нами будут выяснены механизмы влияния отдельных паракринных факторов секретома МСК на клетки Лейдига и клетки Сертоли. Будут установлены механизмы влияния повреждения ниши на секретом МСК. Мы предполагаем, что повреждение ниши будет вызывать увеличение этими клеткам секреции белков, связывающих инсулин-подобный фактор роста (IGFBP). В результате проекта мы выясним влияние продукции МСК белков семейства IGFBP на IGF-1-зависимую гиперактивацию клеток Лейдига. В результате выполнения проекта будет также изучено влияние эстрогена на паракринную активность эндометриальных МСК на модели эстроген-индуцированного роста эндометрия у овариэктомизированных мышей. Мы предполагаем, что в результате этих исследований будут описаны новые механизмы регуляции циклического роста стромы, включая кровеносные сосуды и нервные окончания. Эти процессы создают условия для активной пролиферации и дифференцировки стволовых и прогениторных клеток базального слоя эндометрия. Поэтому предполагаемые результаты не только будут востребованы для понимания фундаментальных механизмов циклического обновления ткани, но и откроет перспективу создания новых препаратов и методов лечения состояний и заболеваний, связанных с недостаточным или чрезмерным ростом эндометрия, в том числе приводящих к бесплодию. В результате выполнения Проекта-2023 будут также выявлены молекулярные мишени, воздействие на которые позволит стимулировать восстановление ниши стволовых клеток. Перспективными кандидатами являются ГФИ (гликозилфосфатидилинозитол)- заякоренные рецепторы, а именно рецептор урокиназы и Т-кадгерин. Критическое значение этих белков для регуляции роста кровеносных сосудов и окончаний нейронов было продемонстрировано нами ранее. На модели ангиотензин-индуцированного старения микрососудов у трансгенных мышей, лишенных экспрессии рецептора урокиназы или Т-кадгерина, будет изучен вклад этих белков в формирование микроокружения стволовых клеток. Наши данные, как и публикации мирового уровня других авторов, указывают на то, что именно активность МСК может определять исход ответа ткани на повреждение – формирование и прогрессию фиброза, либо, напротив, разрешение фиброза и восстановление структурно-функциональной целостности ткани. В результате выполнения Проекта-2023 будут проанализированы механизмы участия про- и антифиброзной субпопуляций МСК, отличающихся по экспрессии рецептора PDGF-альфа, в ответе тканей на повреждение и развитие фиброза. В частности, будут получены результаты относительно представленности в секретомах про- и антифиброзной субпопуляций МСК выявленных нами ранее белков и микроРНК, которые могут опосредовать их анти- и профибротическое действие. Вклад исследуемых молекул в течение процессов фиброза будет проанализирован на моделях in vitro и in vivo. Планируемые результаты Проекта-2023 о механизмах поддержания клеточного состава тканей и его восстановления после повреждения чрезвычайно важны как для фундаментальной науки, так и для разработки методов и подходов регенеративной медицины, направленных на сохранение и восстановление здоровья населения.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Данный проект направлен на выяснение механизмов, лежащих в основе процессов обновления ниши стволовых клеток, гетерогенности стволовых клеток в составе такой ниши и способности этих клеток к направленной дифференцировке и предотвращению развития фиброза. В частности, в задачи проекта входит анализ влияния таких гормонов и нейромедиаторов как норадреналин, серотонин, инсулин и паратиреоидный гормон на самоподдержание МСК, а также коммитирование и дифференцировку этих клеток. В 2023 году для выяснения механизмов формирования контрактильного фенотипа МСК нами был проведен поиск факторов транскрипции, которые запускают и поддерживают этот процесс. Для этого мы провели углубленный биоинформатический анализ массивов данных о составе транскриптомов одиночных клеток. Непосредственный анализ экспрессии факторов транскрипции в таких массивах затруднен ввиду малой представленности их мРНК. Однако на активность факторов транскрипции в анализируемой клетке достоверно указывает повышение экспрессии регулируемых ими генов-мишеней. Поэтому для того чтобы выявить факторы транскрипции, которые могут управлять дифференцировкой МСК, мы проанализировали распределение известных мишеней факторов транскрипции. Для расчета регулонов (транскрипционный фактор вместе с регулируемыми им генами-мишенями) мы использовали метод SCENIC. С помощью такого подходы мы впервые обнаружили, что обработка МСК норадреналином приводит к повышению в них активности транскрипционных факторов, связанных с сократительной активностью клеток, например, MEF2C, NFATC3 и MEF2A. Более того, нам удалось впервые выявить увеличение экспрессии мишеней факторов транскрипции, которые не были описаны ранее как регуляторы сократимых клеток (TRPS1, BRF2, TBLXR1, MZF1, KLF11, MAFF). Наши данные указывают на участие перечисленных факторов в индукции контрактильного фенотипа МСК под действием норадреналина. Мы выявили спектр транскрипционных факторов, которые участвуют в самоподдержании МСК, в том числе KLF2, а также RARG, CREB5, POLR3G, JDP2 и NR2F6. В 2023 году нами были созданы линии иммортализованных МСК с помощью эктопической экспрессии кДНК теломеразы человека в них. Полученные линии иммортализованных клеток сохраняли иммунофенотип и функциональную активность (способность к дифференцировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях, а также чувствительность к гормонам и нейромедиаторам). Такие клетки были использованы для установления роли аденилатциклазы-1 в контроле дифференцировки МСК. При помощи CRISPR/Cas9 D10A-никазной системы мы получили линию клеток с селективным нокаутом этого белка. Используя полученную линию клеток, мы установили, что сигнальный каскад, инициируемый аденилатциклазой 1, необходим для индукции как остеогенной, так и адипогенной дифференцировок. Важной задачей проекта является выяснение механизмов взаимодействия МСК с их микроокружением, в том числе при старении, хроническом воспалении и фиброзе. В 2023 году для выяснения механизмов развития инсулинорезистентности при старении, мы проанализировали состав микроРНК во внеклеточных везикулах контрольных и сенесцентных МСК. С помощью анализа массива микроРНК с использованием веб-сервера sRNAtoolbox нами были выявлен спектр микроРНК, содержание которых повышено в везикулах старых клеток, включая микроРНК 19b и 29c. Среди мишеней микроРНК, характерных для везикул из сенесцентных клеток, мы обнаружили белки PTEN, MAPK1 и Ago1. Подавление экспрессии белка PTEN посредством микроРНК везикул сенесцентных клеток, может обусловливать наблюдаемое нами уменьшение ответа МСК на инсулин путем активации PI3K/AKT-зависимого пути внутриклеточной сигнализации. В результате исследований на модели старения эндотелия in vivo, вызванного системным введением ангиотензина II, мы выявили защитную роль Т-кадгерина в поддержании функциональной активности эндотелиальных клеток. С помощью биоинформатического анализа мы идентифицировали молекулярные мишени, экспрессия которых сопряжена с Т-кадгерином. Ими оказались бета-катенин, VE-кадгерин, N-кадгерин, кавеолин, AdipoR2 (рецептор адипонектина 2 типа), ДНК-метилтрансфераза 1, плакоглобин (поддерживает целостность эндотелиальных клеток сосудов и регулирует VEGF-индуцированное фосфорилирование VE-кадгерина) и ряд других белков. Мы предполагаем, что взаимная регуляция плагоклобина и Т-кадгерина может обусловливать защитное действие Т-кадгерина на эндотелиальные клетки. В рамках задачи по выяснению молекулярных механизмов взаимодействия МСК с клетками ниши сперматогониальных стволовых клеток на данном этапе проекта нами была исследована роль VEGF во взаимодействии МСК с клетками Лейдига и клетками Сертоли. На модели оценки секреторной активности клеток Лейдига показано, что секретом МСК стимулирует выработку тестостерона клетками Лейдига. При этом не наблюдается стимуляции пролиферации клеток Лейдига. Мы показали, что значимый вклад в реализацию эффектов секретома МСК на клетки Лейдига вносят растворимые факторы. Однако вопреки нашим ожиданиям, добавление нейтрализующих антител против VEGF, не снижало эффекта секретома МСК на клетки Лейдига. Это может указывать на необходимость присутствия других факторов для реализации эффектов VEGF. При развитии фиброза МСК в составе стромы находятся под воздействием различных стимулов от профибротического микроокружения, которые могут оказывать существенное воздействие как на клеточный субпопуляционный состав МСК, так и на состав их секретома. На данном этапе мы исследовали, как меняется секретом МСК и субпопуляций этих клеток в профибротическом микроокружении. Ранее в рамках проекта нами была разработана и валидирована модель профибротического микроокружения. Мы установили, что в ответ на профибротические стимулы часть МСК дифференцируется в миофибробласты, а другая часть имеет более высокие инвазивные свойства и сниженную способность к контракции матрикса. Вторая субпопуляция МСК, по данным биоинформатического анализа, может быть выделена с помощью сортировки по экспрессии PDGFRа. При анализе ответа субпопуляций МСК на культивирование в профибротических условиях, мы обнаружили, что секретом PDGFRα+ клеток обогащен белками внеклеточных везикул. Помимо этого, мы выявили в секретоме PDGFRα+ клеток еще несколько белковых паттернов, включая белки-регуляторы клеточной подвижности и адгезии, развития многоклеточных организмов, формирования тканей и сосудистой сети, ответа тканей на повреждение. На основании полученных данных мы предполагаем, что в профибротических условиях паракринные эффекты PDGFRα+ субпопуляции МСК могут быть обусловлены, во-первых, регуляцией функционирования белков, связывающих инсулиноподобные факторы роста, а во-вторых - регуляцией воспалительного ответа. Хроническое воспаление, ключевыми участниками которого выступают М2-макрофаги, является важнейшим патогенетическим звеном фиброза тканей. На данном этапе мы дополнительно исследовали, как М2-макрофаги могут влиять на способность МСК регулировать развитие фиброза. Культивирование МСК в условиях хронического воспаления и оксидативного стресса приводило к появлению маркеров сенесценции у МСК и снижению способности их ВВ подавлять TGFβ1-индуцированную дифференцировку фибробластов в миофибробласты. При дальнейшем культивировании МСК, обработанных КС-М2 или H2O2, в стандартных условиях в течение 14 дней происходило снижение секреции компонентов SASP IL-6 и MCP-1, при этом способность фракции ВВ секретома МСК подавлять TGFβ1-индуцированную дифференцировку фибробластов в миофибробласты восстанавливалась, что говорит о обратимости клеточной сенесцении МСК, развивающейся в условиях короткого воздействия сигналов, ассоциированных с повреждением, и возможном восстановлении регуляторных антифибротических функций МСК. Таким образом, в результате выполнения проекта были получены новые актуальные данные об участии МСК в обновлении и репарации тканей, а также о механизмах нарушения этих процессов при гормональных дисфункциях, старении и хроническом воспалении.

Публикации

1. Басалова Н, Илларионова М, Скрябина М, Виговский М, Толстолужинская А, Примак А, Чечехина Е, Чечехин В, Карагяур М, Ефименко А. Advances and Obstacles in Using CRISPR/Cas9 Technology for Non-Coding RNA Gene Knockout in Human Mesenchymal Stromal Cells Non-Coding RNA, Том 9, Выпуск 5 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ncrna9050049

2. Дьячкова У.Д., Виговский М.А., Басалова Н.А., Ефименко А.Ю., Григорьева О.А. M2-Macrophage-Induced Chronic Inflammation Promotes Reversible Mesenchymal Stromal Cell Senescence and Reduces Their Anti-Fibrotic Properties International Journal of Molecular Sciences, Т.24 №23, 17089 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms242317089

3. Н.А. Басалова, С.С. Джауари, Ю.А. Юршев, А.Л. Примак, А.Ю. Ефименко, В.А. Ткачук, М.Н. Карагяур State-of-the-art: применение внеклеточных везикул и препаратов на их основе для нейропротекции и стимуляции регенерации ткани головного мозга после повреждения Нейрохимия, T. 40, № 4, стр. 367-380 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.31857/S1027813323040076

4. Чечехин В.И., Иванова А.И., Кулебякин К.Ю., Антропова Ю.Г., Карагяур М.Н., Скрябина М.Н., Чечехина Е.С., Басалова Н.А., Григорьева О.А., Сысоева В.Ю., Калинина Н.И., Ткачук В.А., Тюрин-Кузьмин П.А. Peripheral 5-HT/HTR6 axis is responsible for obesity-associated hypertension Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research, - (год публикации - 2024) https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2023.119651

5. Волошин Н., Тюрин-Кузьмин П., Карагяур М., Акопян Ж., Кулебякин К. Practical Use of Immortalized Cells in Medicine: Current Advances and Future Perspectives International Journal of Molecular Sciences, Том 24, Выпуск 16 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms241612716

6. Еремичев Р.Ю., Макаревич П.И. Рецепция повреждения и активация роста соединительной ткани: ключевые регуляторные этапы регенерации у человека Цитология, - (год публикации - 2024)

7. Монакова А.О., Сагарадзе Г.Д., Басалова Н.А., Попов В.С., Балабаньян В.Ю., Ефименко А.Ю. Изучение вклада фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в реализацию регенеративных эффектов секретома мезенхимных стромальных клеток при нарушениях сперматогенеза Гены и клетки, том 18, с. 29-30 (год публикации - 2023)

8. Николаев М.Ю., Тюрин-Кузьмин П.А., Кулебякин К.Ю., Воронцова М.В ИНГИБИТОРНЫЙ АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ КАЛЬЦИЕВОГО СИГНАЛИНГА В МСК В ОТВЕТ НА ПАРАТГОРМОН РЕЦЕПТОРЫ И ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ, том 1, 170-173 (год публикации - 2023)

9. Усачев В.А., Кулебякин К.Ю., Тюрин-Кузьмин П.А., Волошин Н.С., Зубарев И.В., Николаев М.Ю., Воронцова М.В. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ УЧАСТИЯ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ И ФОСФОЛИПАЗЫ С В ПТГ-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МСК РЕЦЕПТОРЫ И ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ, том 1, стр 180-182 (год публикации - 2023)