КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 24-25-00397
НазваниеРоль дисфункции ферментов лизосом в олигомеризации альфа-синуклеина и накоплении его модифицированных форм в клетках крови при болезни Паркинсона и в экспериментах in vitro.
РуководительЕмельянов Антон Константинович, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт", Ленинградская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2024 г. - 2025 г. |
Конкурс№89 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-402 - Медицинская генетика
Ключевые словаглюкоцереброзидаза, клеточные модели, болезнь Паркинсона, мутации генов, лизосомные болезни накопления, аутофагия, альфа-синуклен
Код ГРНТИ34.15.00; 76.03.31
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Ключевую роль в патогенезе болезни Паркинсона (БП) играет накопление нейротоксичных форм белка альфа-синуклеина в тканях головного мозга. Показано, что ряд химических модификаций альфа-синуклеина способствуют его олигомеризации (Hodara et al, 2004, Biol Chem, 279:47746-53). При этом дисфункция лизосом рассматривается, как одна из возможных причин накопления альфа-синуклеина в клетках. К настоящему времени описан ряд генов лизосомных болезней накопления (ЛБН), мутации в которых ассоциированы с риском развития БП. Во многих популяциях, в том числе и в России, показано, что мутации в гене GBA, кодирующем лизосомный фермент глюкоцереброзидазу (GBA), являются фактором высокого риска БП (Emelyanov et al, 2018, doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2018.06.027; Ran C. et al., 2016, Neurobiol. Aging., V. 4. P. 212.e215–212.e211). Все больше появляется данных о кумулятивном вкладе мутаций генов ЛБН в риск развития данного заболевания. Показано, что дисфункция GBA приводит к нарушению процесса аутофагии и накоплению альфа-синуклеина в клетках, а также плазме крови у пациентов с ЛБН и БП (Magalhaes J, et al. Hum Mol Genet. 2016;25(16):3432-3445; Pchelina et al., Neuroscience Letters. 636:70-76. 2017, 58). Однако, остается неясным приводят ли другие мутации в генах ЛБН к нарушению процесса аутофагии и накоплению альфа-синуклеина.
Целью настоящего проекта является изучение влияния дисфункции ферментов лизосом на олигомеризацию альфа-синуклеина, накопление его модифицированных форм и уровень аутофагии в различных клетках крови пациентов с БП с мутациями в генах, ассоциированных с ЛБН, а также в экспериментах in vitro на культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y.
Ранее в рамках проведения секвенирования кодирующей области 44 генов, ассоциированных с ЛБН, среди пациентов с БП нами были выявлены пациенты с редкими патогенными вариантами в ряде генов, в частности у пациентов с БП были обнаружены мутации в генах ARSA (Senkevich K.A. et al., 2023, Movement disoders, in press), GLA, ASAH1, MAN2B1, GALC (Senkevich K.A. et al., 2023, Brain, 146;1859-1872), также за годы исследований нами сформирована группа пациентов с мутациями N370S и L444P в гене GBA. В рамках данного проекта нами впервые планируется проведение оценки олигомерного альфа-синуклеина, его модифицированных форм (фосфорилированный, нитрозилированный, сумоилированный, гликированный) и уровня аутофагии в клетках периферической крови пациентов с БП с различными мутациями в генах ЛБН (GLA, ASAH1, MAN2B1, GALC, ARSA, GBA), пациентов со спорадической формой БП (сБП) и индивидуумов контрольной группы методом дот- и вестерн-блоттинга, а также проточной цитометрией.
На культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессией альфа-синуклеина (SNCA) человека будет оценено влияние дисфункции лизосом на агрегацию альфа-синуклеина и уровень модифицированных форм альфа-синуклеина. Подавление активности лизосомных ферментов будет генерироваться с использованием малых интерферирующих РНК (миРНК). Впервые будет оценено влияние дисфункции ферментов арилсульфатазы А (ARSA), альфа-галактозидазы А (GLA), а также глюкоцереброзидазы на накопление указанных выше модифицированных форм альфа-синуклеина in vitro.
У пациентов исследуемых групп в сухих пятнах крови, а в случае клеточной культуры – сухих пятен клеток, будет проведено измерение активности наиболее значимых ферментов лизосом (глюкоцереброзидаза, альфа-галактозидаза, альфа-глюкозидаза, галактоцереброзидаза, сфингомиелиназа, альфа-идуронидаза) и концентрации их субстратов (гексазилсфингозин, лизосфингомиелин, лизоглоботриаозилсфингозин, лизосфингомиелин-509) с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС, что позволит сопоставить данные показатели с уровнем оцениваемых форм альфа-синуклеина, а также аутофагии.
Таким образом, выполнение проекта позволит прояснить влияние дисфункции ферментов лизосом на метаболизм альфа-синуклеина при БП, а также выявить потенциальные маркеры развития заболевания и молекулярные мишени для разработки потенциальной фармакологической терапии.
Ожидаемые результаты
В рамках проводимого исследования нами будут сформированы группы пациентов с мутациями в генах, ассоциированных с ЛБН. В течение первого года будет продолжен скрининг мутаций N370S и L444P гена GBA, что позволит расширить группу пациентов с мутациями в генах, ассоциированных с ЛБН.
В настоящем проекте нами впервые будет проведена оценка уровня олигомерных и модифицированных форм альфа-синуклеина в макрофагах и эритроцитах пациентов с мутациями в генах ЛБН, а также на культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y с опосредованным нокдауном одного или нескольких одновременно генов ЛБН, что позволит оценить влияние их дисфункции на метаболизм альфа-синуклеина в клетке. Отдельно в этих же группах впервые будет оценено влияние дисфункции генов ЛБН на уровень аутофагии с последующей оценкой его корреляции с уровнем изучаемых форм альфа-синуклеина. Также оценка указанных выше параметров будет впервые проведена в клетках периферической крови пациентов с сБП, не принимающих на момент исследования Л-ДОФА-содержащих препаратов, которые как было показано ранее, способны влиять на уровень экспрессии гена SNCA (Ina Schmitt, 2015, Movement Disorders 30(13):1794-801).
Кроме того будут созданы клеточные линии SH-5YSY, гиперэкспрессирующие ген альфа-синуклеина человека, кодирующий наиболее представленную в клетках изоформу белка длиной 140 а.к.. На созданной клеточной модели с использованием опосредованного нокдауна одного или нескольких генов (ARSA, GLA, GBA), мутации в которых ассоциированы с ЛБН, будет впервые оценена олигомеризация белка альфа-синуклеина, уровень его модифицированных форм (фосфорилированный, нитрозилированный, сумоилированный, гликированный) и аутофагии.
Следует отдельно отметить, что оценка уровня модифицированных форм альфа-синуклеина в клетках крови будет осуществляться с использованием подходов термообогащения и деплеции гемоглобина в клеточных лизатах по описанной методике, применяемой ранее только для оценки модифицированных форм альфа-синуклеина в эритроцитах периферической крови пациентов с сБП без учета приема Л-ДОФА-содержащих препаратов. Кроме того, оценка олигомерных форм альфа-синуклеина в эритроцитах исследуемых групп будет проводиться с использованием метода дот-блоттинга и антител 5G4, специфичных только олигомерным формам белка.
Проведение настоящего исследования позволит при подавлении экспрессии указанных генов ЛБН впервые сопоставить активность ферментов (глюкоцереброзидаза, альфа-галактозидаза, альфа-глюкозидаза, галактоцереброзидаза, сфингомиелиназа, альфа-идуронидаза) и концентрацию их субстратов (гексазилсфингозин, лизосфингомиелин, лизоглоботриаозилсфингозин, лизосфингомиелин-509) как в периферической крови, так и культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y, с указанными выше параметрами. Немаловажным является тот факт, что в рамках настоящего проекта будет проведена оценка влияния дисфункции одного или нескольких ферментов лизосом (арилсульфатаза А и альфа-галактозидаза А, глюкоцереброзидаза), на активность других лизосомальных ферментов (глюкоцереброзидаза, альфа-галактозидаза, альфа-глюкозидаза, галактоцереброзидаза, сфингомиелиназа, альфа-идуронидаза) и концентрацию их субстратов (гексазилсфингозин, лизосфингомиелин, лизоглоботриаозилсфингозин, лизосфингомиелин-509) на культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессией гена альфа-синуклеина.
Проведенное исследование позволит приблизиться к пониманию молекулярного механизма развития БП, включая формы заболевания, ассоциированные с мутациями в генах ЛБН. Следует отметить, что в настоящее время лечение БП имеет симптоматических характер, однако, в случае GBA-ассоциированных форм заболевания появляются новые подходы терапии, основанные на действии фармакологических шаперонов. В связи с этим выяснение влияния дисфункции ферментов лизосом на метаболизм альфа-синуклеина при БП в значительной степени позволит расширить понимание молекулярного механизма развития БП, ассоциированной с мутациями в генах ЛБП, обозначить новые мишени для лечения таких форм заболевания, а также выявить биомаркеры, позволят в том числе отслеживать эффективность лечения препаратами на основе фармакологических шаперонов.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ