Поиск эпигенетических маркеров воздействия химических веществ на геном мужских репродуктивных клеток и качество семени у человека и лабораторных крыс

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 18-15-00202

НазваниеПоиск эпигенетических маркеров воздействия химических веществ на геном мужских репродуктивных клеток и качество семени у человека и лабораторных крыс

Руководитель Сергеев Олег Владимирович, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №28 - Конкурс 2018 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова малая некодирующая РНК, ДНК метилирование, качество семени, репродуктивное здоровье, диоксины, свинец, лонгитудинальное исследование, когорта, эпигеном сперматозоидов, молекулярная эпидемиология, эпигенетическая эпидемиология, химические вещества нарушающие работу эндокринной системы, сперматогенез

Код ГРНТИ34.15.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В современном обществе наблюдается достаточно высокая частота бесплодия, до 40%, вызванного так называемым "мужским" фактором, когда ведущая роль в бесплодии принадлежит мужчине (Inhorn and Patrizio, 2015). По данным разных авторов в разных популяциях 10-20% мужчин репродуктивного возраста являются бесплодными (Barratt et al., 2017). Также наблюдается тренд уменьшения концентрации сперматозоидов среди мужчин западных стран в течение последнего полувека (Levine et al., 2017). Процессы сперматогенеза и созревания сперматозоидов включают в себя каскад эпигенетических изменений (Wu et al., 2015b). Изучение эпигенома сперматозоидов представляет очень перспективное направление по нескольким причинам. Во-первых, эпигенетические маркеры нарушения сперматогенеза и созревания сперматозоидов недостаточно изучены. Во-вторых, явно недостаточно изучено специфическое воздействие разнообразных факторов среды, включая химические факторы, на эпигеном. В-третьих, эпигенетические маркеры связаны с качеством и количеством сперматозоидов. И, в-четвертых, что может быть особенно важно - репрограммирование эпигенома половых клеток может быть передано следующему поколению, что может привести к нарушению развития потомства, как на этапе развития эмбриона, так и в последующей жизни. Эпигенетические изменения в сперматозоидах включают метилирование ДНК, малую РНК и модификацию гистонов. Из этих трех эпигенетических механизмов более изучено метилирование ДНК сперматозоидов в норме и при бесплодии, больше в животных моделях, меньше у человека (Laqqan et al., 2017, Xu et al., 2016) Профиль малой некодирующей РНК (snc RNA), к которой относят транспортную РНК (tRNA), микро РНК (mi RNA) и piRNA (Estill and Krawetz, 2016, Garcia-Lopez et al., 2015) в сперматозоидах на данный момент изучен существенно меньше. Недавно опубликованные данные свидетельствуют о наличии динамических изменений в профиле малой РНК сперматозоидов во время ее созревания в эпидидимусе. Целями заявляемого исследования являются: 1. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и лейкоцитов, его связи с хроническим перипубертатным воздействием химических веществ и качеством семени в проспективной когорте молодых мужчин, наблюдаемых с восьмилетнего возраста. 2. Изучение профиля малой некодирующей РНК сперматозоидов и клеток печени, его связи с перинтальным воздействием промышленных ингибиторов горения (БДЭ-47) и качеством спермы в экспериментальной модели крыс. В предыдущем проекте РНФ (#14-45-00065) мы анализировали изменения в ДНК-метилировании и ретенции гистонов в сперматозоидах и соматических клетках молодых мужчин и лабораторных крыс, ассоциированных с воздействием факторов окружающей среды. Малые некодирующие РНК являются третьим основным механизмом эпигенетического репрограммирования клеток и тканей. В данном проекте мы исследуем профиль малой некодирующей РНК, используя те же биологические образцы, что были использованы для изучения метилирования ДНК, для получения полной картины эпигенетических изменений в сперматозоидах и соматических тканях, возникающих в результате воздействий химических веществ. Проект состоит из двух компонентов. Первый – это молекулярно-эпидемиологическое (эпигенетически-эпидемиологическое) исследование, для которого были получены образцы сперматозоидов и лейкоцитов молодых мужчин в ходе крупного родительского проспективного когортного исследования «Russian Children’s Health. Male Reproductive SubStudy», начавшегося в 2003 году. Это исследование является уникальным, как по периоду воздействия (перипубертат), по рассматриваемым химическим веществам (диоксины, свинец), так и по комплексу эпигенетических изменений (метилирование ДНК и профиль малой РНК) в сперматозоидах, выявляемых с помощью масштабного параллельного секвенирования. Для анализа была выбрана субкогорта 51 участников из когорты 516 мужчин. Второй компонент – это молекулярно-токсикологический эксперимент, который также является уникальным по нескольким факторам. Мы впервые в мире изучаем перинатальное воздействие БДЭ-47, представителя класса ингибиторов горения (антипиретиков), добавляемых в промышленных масштабах в оргтехнику, мебель и строительные материалы, на эпигеном сперматозоидов. В токсикологическом эксперименте была использована экспозиционная доза, релевантная средней экспозиции, которую испытывает человек в повседневной жизни. У животных впервые используется изучение эпигенома сперматозоидов в разные периоды их полового развития, на 65-ый (пубертат) и 120-ый (половозрелость) постнатальные дни. Методологической основой заявляемого проекта является технология масштабного параллельного секвенирования (NGS), которая будет использована для анализа изменения мнк РНК, выделенной из сперматозоидов и лейкоцитов крови мужчин и сперматозоидов и клеток печени лабораторных животных. Протокол выделения мнк РНК, проверка качества и создания библиотек разработан с участием нашего консультанта, Др. Кравец (Krawetz et al., 2011, Mao et al., 2013, Goodrich et al., 2013, Mao et al., 2014). мнк РНК из образцов сперматозоидов была успешно выделена в лаборатории д-ра Логачевой (рис. 2) в тестовом эксперименте, в котором использовались образцы, накопленные в ходе текущего исследования. Будет проведено секвенирование на Illumina HiSeq 2000 мнк РНК всех образцов, включая 51 образец сперматозоидов и 51 образец лейкоцитов мужчин, а также 36 образцов сперматозоидов и клеток печени крыс. Для проекта сформирована междисциплинарная международная команда исследователей на базе трех институтов, которая в ходе выполнения предыдущего проекта РНФ позволила успешно проделать запланированную работу по поиску молекулярных биологических маркеров воздействия промышленных химических веществ на геном репродуктивных клеток и фертильность у мужчин (проект РНФ 14-45-00065). Команда включает в себя репродуктивного эндокринолога и эпидемиолога (Сергеев), молекулярных биологов-генетиков с большим опытом лабораторной работы на современной приборной базе, включая HiSeq 2000 (Логачева, Штратникова, Ашапкин), молекулярного эпидемиолога, являющегося экспертом в области эпигеномики сперматозоидов (Пилзнер), молекулярного токсиколога-биолога (Суворов), биоинформатиков, специализирующихся на методах, применяемых в эпигенетике (Медведева, Шершебнев). У проекта есть консультанты, с которыми налажены давние связи в текущем лонгитудинальном проекте, финансируемом Национальным Институтом Здоровья США «Воздействие фталатов и химических смесей на пубертат и качество семени» (субконтрактное соглашение между Гарвардской Школой Общественного Здоровья и НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ). Это эпидемиолог, изучающий влияние химических веществ на репродуктивное здоровье, один из мировых лидеров в этой области, директор Департамента окружающей среды и здоровья Гарвардской школы общественного здоровья, Расс Хаузер и Стивен Кравец, США, автор протоколов выделения мнк РНК из спермотозоидов с последующим секвенированием и биоинформатическим анализом. У нашей команды имеется большой, в том числе совместный, опыт в доступе и использовании NGS (отчет проекта РНФ, http://xn--m1afn.xn--p1ai/prjcard?rid=14-45-00065) и изучения эпигенетических маркеров. Анализ изменения метилирования ДНК (проект РНФ 14-45-00065) выявил нарушения как в эпидемиологическом исследовании (сперматозоиды человека), так и в токсикологическом эксперименте (сперматозоиды крысы). В частности, мы идентифицировали 52 дифференциально метилированных региона (ДМР) в сперматозоидах в двух группах с наибольшей и наименьшей перипубертатной экспозицией диоксинами, используя образцы из проспективной субкогорты мальчиков\молодых мужчин (Pilsner et al., 2017). В экспериментальной модели на крысах, перинатально экспонированных БДЭ-47 (ингибитор горения), мы выявили 21 и 9 ДМР, сравнивая экспонированную группу и контрольную на 65 и 120 дни развития, соответственно (Suvorov et al., 2017). При изучении двух групп молодых мужчин с разным качеством семени, нами обнаружены 6 значимо дифференциально метилированных регионов (при разнице метилирования больше 10%, q < 0.05), ассоциированных с 6 генами (STC2, BVES-AS1, USP35, EFCAB13, KAZN, LOC101929268) в группе с пониженным качеством семени по сравнению с нормальным. Интересно, что два из 6 ДМР (BVES-AS1 и LOC101929268) ассоциированы с малой некодирующей РНК (мнкРНК), которые являются высокоэкспрессируемыми в яичках. Таким образом, ранее полученные данные о влиянии химических факторов среды на такие молекулярно-эпигенетические механизмы, как метилирование ДНК и ретенцию гистонов, наряду с изученным в рамках подаваемого проекта изменением профилей мнк РНК, лягут в основу комплексного подхода, раскрывающего методологически доступные на сегодняшний день изменения эпигенома сперматозоидов под воздействием химических факторов окружающей среды.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Суворов А.Н., Наумов В.А., Штратникова В.Ю., Логачева М.Д., Шершебнев А.А.,Ву Г., Герасимов Е.С., Желудкевич А.А., Пилзнер Д.Р., Сергеев О.В. Rat Liver Epigenome Programing by Perinatal Exposure to 2,2’,4’4’ –Tetrabromodiphenyl Ether Epigenomics (год публикации - 2019)
10.2217/epi-2019-0315

2. Сергеев О.В., Никитин А.И. Концепции первопричин здоровья и болезней на ранних периодах развития (DOHaD) и отцовских первопричин, передаваемых следующим поколениям (POHaD) Акушерство, Гинекология и Репродукция (год публикации - 2019)
10.17749/2313-7347.2019.13.4

3. Суворов А.Н., Наумов В.А., Штратникова В.Ю., Пилзнер Д.Р., Желудкевич А.А., Герасимов Е.С., Логачева М.Д., Сергеев О.В. Aging induces profound changes in sncRNA in rat sperm and these changes are modified by perinatal exposure to environmental flame retardant International Journal of Molecular Sciences, 21, 8252 (год публикации - 2020)
10.3390/ijms21218252

4. Сергеев О.В., Никитин А.И. Developmental origins of health and disease (DOHaD) and paternal origins of health and disease (POHaD). Multigenerational inheritance Obstetrics, Gynecology and Reproduction, Volume 13, Issue 4; pages 326-336 (год публикации - 2019)
10.17749/2313-7347.2019.13.4.326-336

5. Абу Гайда Р., Сергеев О., Бернс Д.С., Виллиамс П.Л., Ли М.М., Коррик С.А., Смигулина Л., Диков Ю., Хаузер Р., Мингез-Аларкон Л. Peripubertal serum concentrations of organochlorine pesticides and semen parameters in Russian young men Environmental International, Volume 144, November 2020, #106085 (год публикации - 2020)
10.1016/j.envint.2020.106085

6. Сергеев О., Штратникова В., Наумов В., Безуглов В., Логачева М., Смигулина Л., Диков Ю., Денисова Т., Суворов А., Пилзнер Д.Р., Хаузер Р. Sperm small non‐coding RNA profile obtained by NGS and semen quality among healthy young adults Andrology, Volume 8, Issue S2 Special Issue:Andrology 2020: International Meeting of the ISA, EAA and DGA, 5–9 December 2020, Digital. Pages 68-84 (год публикации - 2020)
10.1111/andr.12937

7. Штратникова В., Наумов В., Безуглов В., Логачева М., Смигулина Л., Диков Ю., Денисова Т., Суворов А., Пилзнер Д.Р., Хаузер Р., Кравец С., Сергеев О. Small RNA library preparation for human sperm of young adults Journal fur Reproduktionsmedizin und Endokrinologie, J. Reproduktionsmed. Endokrinol 2020; 17 (Supplementum 1), 5-85 (год публикации - 2020)

8. Пилзнер Д.Р., Шершебнев А., Ву Г., Марчо Ч., Дрибноходова О., Штратникова В., Сергеев О., Суворов А. Aging-induced changes in sperm DNA methylation are modified by low dose of perinatal flame retardants Epigenomics (год публикации - 2020)

Публикации