Новые мультитаргетные гибридные белки на основе высокоспецифичного мутантного варианта цитокина TRAIL DR5-B с эффекторными пептидами для параллельного воздействия на различные сигнальные пути, влияющие на развитие опухолей

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-14-00224

НазваниеНовые мультитаргетные гибридные белки на основе высокоспецифичного мутантного варианта цитокина TRAIL DR5-B с эффекторными пептидами для параллельного воздействия на различные сигнальные пути, влияющие на развитие опухолей

Руководитель Долгих Дмитрий Александрович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №55 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова TRAIL; рецептор-селективный вариант TRAIL-DR5-B; рецепторы смерти; рецептор DR5; апоптоз; VEGFR; iRGD пептид; таргетная терапия рака; гибридный белок; белковая инженерия

Код ГРНТИ62.99.31

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одним из важных признаков раковых клеток является способность уходить от апоптоза, индуцируемого лекарственными средствами. При этом увеличивается устойчивость клеток как к обычной противоопухолевой терапии, например, химиотерапии, лучевой терапии, так и к таргетным терапевтическим препаратам. Преодоление устойчивости путем реактивации апоптоза является основным направлением поиска перспективных способов лечения рака. Эффективная индукция апоптоза с использованием новых терапевтических препаратов может быть ключевой стратегией предотвращения рецидивов и метастазов. Создание лекарств в данной области является непростой задачей, поскольку процесс апоптоза осложняется разнообразными механизмами резистентности и многогранной связью с перекрестными молекулярными путями. Основные направления разработки последних десятилетий - молекулы, ингибирующие антиапоптотические и усиливающие проапоптотические пути. Для успешного внедрения новых молекул необходимы исследования фундаментальных механизмов возникновения резистентности и тщательный дизайн инновационных препаратов. Лиганды суперсемейства фактора некроза опухолей (TNF) являются эффективными индукторами апоптотической гибели клеток, что делает их перспективными агентами для терапии рака и аутоиммунных заболеваний. TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) является членом суперсемейства TNF, который вызывает избирательную гибель опухолевых клеток, связываясь с рецепторами смерти DR4 и DR5 и индуцируя апоптоз. Для таргетной терапии злокачественных опухолей были разработаны различные рекомбинантные формы TRAIL, включая его рецептор-специфичные варианты, а также агонистические моноклональные антитела к рецепторам DR4 и DR5. Несмотря на то, что многие из этих средств продемонстрировали значительную противоопухолевую активность в доклинических исследованиях, их терапевтический эффект в клинических испытаниях был ограничен. Для усиления апоптотического сигнала в настоящее время разрабатываются новые молекулы TRAIL следующего поколения в виде гибридных белков, повышающих кластеризацию рецепторов смерти и усиливающих индукцию апоптоза. Нами был впервые получен уникальный мутантный вариант цитокина TRAIL DR5-B, который связывается с рецептором смерти DR5 так же эффективно, как TRAIL дикого типа, но практически не связывается с рецептором смерти DR4 и рецепторами-ловушками DcR1, DcR2 и OPG, блокирующими TRAIL-индуцированный апоптоз. Наши эксперименты показали, что DR5-B в разы эффективнее индуцирует гибель опухолевых клеток по сравнению с исходным TRAIL в большинстве линий опухолевых клеток как отдельно, так и при комбинированном воздействии c химиопрепаратами доксорубицином, бортезомибом, паклитакселом, цисплатином и панобиностатом. Кроме того, DR5-B не проявил цитотоксичности по отношению к нетрансформированным клеткам. На ксенографтных мышиных моделях колоректальной карциномы было показано, что DR5-B в 2,5-3 раза эффективнее ингибирует рост опухолей по сравнению с TRAIL дикого типа. Целью данного проекта является получение новых таргетных препаратов с повышенными противоопухолевыми свойствами на основе рецептор-специфичного варианта противоопухолевого цитокина TRAIL DR5-B. Планируется получение гибридного белка с пептидом, специфичным к рецептору фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), а также с пептидом iRGD, специфичным к рецептору нейропилин NRP-1. NRP-1 служит ко-рецептором рецептора VEGFR и играет важную роль в опухолевом ангиогенезе. Содержание VEGFR и NRP-1 в быстрорастущих опухолях значительно выше, чем в окружающих тканях, что может дополнительно повысить эффективность противоопухолевой терапии гибридными белками. Циклический пептид iRGD включает мотив Arg-Gly-Asp (RGD) и имеет высокую способность к связыванию с интегринами αvβ3 и αvβ5 в опухолевых сосудах и во внесосудистой паренхиме опухоли. Расщепленная форма iRGD, связываясь с NRP-1, запускает NRP-1-зависимый эндоцитоз, что приводит к усиленному проникновению в опухоль. Кроме того, iRGD демонстрирует низкую токсичность для нормальных клеток. Для достижения цели проекта планируется получить три варианта гибридных белков: DR5-B с VEGFR-специфичным пептидом HRH (HRHTKQRHTALH) на N-конце; DR5-B с пептидом iRGD на С- конце; и третий вариант гибридного белка с обоими пептидами на N- и С- концах. Предполагается, что получение гибридных белков с аффинностью к нескольким опухолевым мишенями позволит преодолеть резистентность клеток к DR5-B и расширить применение препаратов на основе DR5-B в терапии неопластических заболеваний. Гибридные белки HRH-DR5-B, DR5-B-iRGD и HRH-DR5-B-iRGD будут получены путем бактериальной экспрессии и очищены методами аффинной и ионообменной хроматографии. Будут исследованы физико-химические свойства препаратов. Будут определены степень тримеризации молекул и константы диссоциации с рецепторами DR5, VEGFR1, VEGFR2 для белка HRH-DR5-B, с рецепторами DR5 и интегринами для белка DR5-B-iRGD, а в случае гибридного белка HRH-DR5-B-iRGD со всеми указанными рецепторами. Будет проведен сравнительный анализ цитотоксической активности полученных гибридных белков с DR5-B в 2D- и 3D- системах опухолевых клеток различного происхождения. Планируется определить степень интернализации рецепторов DR5 и NRP-1 при связывании с гибридными белками на опухолевых клеточных линиях и накопление гибридных белков в 3D in vitro моделях на основе опухолевых клеточных сфероидов. Для всех полученных гибридных белков будут исследованы ключевые элементы DR5-опосредованного апоптотического сигналинга, включая активацию каспазы 8 и протеолиз PARP, а также механизмы лиганд-опосредованного внутриклеточного транспорта рецептора DR5. На финальном этапе работы планируется исследовать противоопухолевые свойства полученных гибридных белков на ксенографтных моделях опухолей колоректального рака человека (HCT116 и HT-29) в иммунодефицитных мышах. Для этого гибридные белки будут очищены в препаративных количествах и, по определенным нами ранее схемам, будут вводиться внутривенно в организм животных. Будет проведен сравнительный анализ торможения роста опухолей и выживаемости животных под воздействием DR5-B и полученных на его основе новых гибридных белков. Наиболее эффективный вариант препарата будет рекомендован для дальнейших доклинических и клинических исследований как новое эффективное средство для таргетной терапии опухолей.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Артыков А.А., Яголович А.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Трушина Д.Б., Гаспарян М.Э. Death Receptors DR4 and DR5 Undergo Spontaneous and Ligand-Mediated Endocytosis and Recycling Regardless of the Sensitivity of Cancer Cells to TRAIL Frontiers in Cell and Developmental Biology, Volume 9, article 733688 (год публикации - 2021)
10.3389/fcell.2021.733688

2. Яголович А., Кусков А., Куликов П, Курбанова Л., Багров Д., Артыков А., Гаспарян М.Э., Сизова С., Олейников В., Гилева А., Кирпичников М., Долгих Д., Марквичева Е. Amphiphilic Poly(N-vinylpyrrolidone) Nanoparticles Conjugated with DR5-Specific Antitumor Cytokine DR5-B for Targeted Delivery to Cancer Cells Pharmaceutics, Volume 13, p.1413 (год публикации - 2021)
10.3390/pharmaceutics13091413

3. Яголович А.В., Артыков А.А., Исакова А.А., Воронцова Е.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Гаспарян М.Э. Optimized Heterologous Expression and Efficient Purification of a New TRAIL-Based Antitumor Fusion Protein SRH-DR5-B with Dual VEGFR2 and DR5 Receptor Specificity International Journal of Molecular Sciences, №23(11), p. 5860 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms23115860

4. Исакова А.А., Артыков А.А., Воронцова Е.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Гаспарян М.Э., Яголович А.В. Application of an Autoinduction Strategy to Optimize the Heterologous Production of an Antitumor Bispecific Fusion Protein Based on the TRAIL Receptor-Selective Mutant Variant in Escherichia coli Molecular Biotechnology, Published online ahead of print 12 September 2022 (год публикации - 2022)
10.1007/s12033-022-00561-6

5. Яголович А.В., Исакова А.А., Артыков А.А., Воронцова Е.В., Мазур Д.В., Антипова Н.В., Павлюков М.С., Шахпаронов М.И., Гилева А.М., Марквичева Е.А., Плотникова Е.А., Панкратов А.А., Крпичников М.П., Долгих Д.А. DR5-Selective TRAIL Variant DR5-B Functionalized with Tumor-Penetrating iRGD Peptide for Enhanced Antitumor Activity against Glioblastoma International Journal of Molecular Sciences, №23(20), p.12687 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms232012687

6. Яголович А.В., Гаспарян М.Э., Долгих Д.А. Recent Advances in the Development of Nanodelivery Systems Targeting the TRAIL Death Receptor Pathway Pharmaceutics, 15, 515 (год публикации - 2023)
10.3390/pharmaceutics15020515

7. Гилева А., Трушина Д., Яголович А., Гаспарян М., Курбанова Л., Смирнов И., Буров С., Марквичева Е. Doxorubicin-Loaded Polyelectrolyte Multilayer Capsules Modified with Antitumor DR5-Specific TRAIL Variant for Targeted Drug Delivery to Tumor Cells Nanomaterials, 13, 902 (год публикации - 2023)
10.3390/nano13050902

8. Исакова А.А., Артыков А.А., Плотникова Е.А., Трунова Г.В., Хохлова В.А., Панкратов А.А., Шувалова М.Л., Мазур Д.В., Антипова Н.В., Шахпаронов М.И., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Гаспарян М.Э., Яголович А.В. Dual targeting of DR5 and VEGFR2 molecular pathways by multivalent fusion protein significantly suppresses tumor growth and angiogenesis International Journal of Biological Macromolecules, 255, 128096 (год публикации - 2024)
10.1016/j.ijbiomac.2023.128096

Публикации