Разработка комплексного подхода к регенеративной терапии остеоартроза с использованием инъекционной формы биомиметика внеклеточного матрикса с клеточными сфероидами

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-15-00251

НазваниеРазработка комплексного подхода к регенеративной терапии остеоартроза с использованием инъекционной формы биомиметика внеклеточного матрикса с клеточными сфероидами

Руководитель Севастьянов Виктор Иванович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации , г Москва

Конкурс №55 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-405 - Регенеративная медицина

Ключевые слова хрящевая ткань, мезенхимальные стромальные клетки, децеллюляризованный матрикс, in vivo, остеоартроз, регенерация

Код ГРНТИ34.03.37

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Данный проект направлен на решение актуальной медицинской проблемы восстановления повреждений суставного хряща. Для этого предлагается использование клеточных сфероидов на основе мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в комбинации с биомиметиком внеклеточного матрикса хрящевой ткани. В отличие от большинства существующих подходов к регенерации хряща, подразумевающих сборку биоинженерных конструкций ex vivo с их последующей хирургической имплантацией, нами будет разработана технология получения оригинальной клеточно-инженерной конструкции (КИК), пригодной для внутрисуставной инъекции. Ожидается, что ее применение будет обладать высоким терапевтическим эффектом, обусловленным активацией регенеративного потенциала реципиента в дополнение к непосредственному замещению дефекта имплантируемыми тканеподобными структурами. «Золотым стандартом» в клеточной терапии заболеваний суставов на сегодняшний день является трансплантация аутологичных хондроцитов. Однако, во многих клинических ситуациях выделение их первичных культур для последующего наращивания невозможно. В качестве альтернативы аутологичным хондроцитам нами будут рассмотрены МСК. По своей природе эти клетки обладают способностью к направленной дифференцировке в различные мезенхимные ткани, включая хрящевую. Также известны иммуномодулирующие свойства МСК, делающие возможным клиническое применение аллотрансплантатов на их основе. Благодаря этим качествам МСК представляются нам перспективным клеточным материалом для восстановления суставных дефектов, что подкрепляется также их доступностью и отсутствием этических ограничений. Для выбора оптимального источника клеток будут получены первичные культуры МСК из подкожной жировой ткани, пульпы зуба и Вартонова студня пуповины человека. В качестве положительного контроля будут использованы первичные хондроциты. Хондрогенный потенциал различных типов МСК будет подвергнут разностороннему сравнительному анализу, при этом будут рассмотрены два принципиально разных способа их трехмерного культивирования. В первом случае клетки в виде суспензии будет нанесены на децеллюляризированный хрящ. Во втором варианте на их основе будут получены сфероиды – небольшие агрегаты, состоящие из нескольких тысяч клеток каждый. При такой форме культивирования клетки имеют возможность продуцировать собственный внеклеточный матрикс (ВКМ), что способствует хондрогенной дифференцировке. Важным свойством сфероидов является способность к слиянию между собой и с другими тканевыми структурами, что позволяет рассчитывать на их эффективную иммобилизацию в зоне повреждения при введении их в суставную полость. Параллельно в ходе реализации проекта будут проводиться исследования, направленные на определение оптимального состава и физико-химических свойств клеточного носителя - биологического миметика внеклеточного матрикса суставного хряща, являющегося вторым основным компонентом КИК помимо клеток. Для этого будет разработана оригинальная технология получения инъекционной формы КИК на основе микрочастиц децеллюляризованного хряща свиньи, максимально сохраняющего биохимический состав и архитектонику нативного ВКМ хрящевой ткани. Применяемая процедура децеллюляризации тканей обеспечивает разрушение клеток при максимальном сохранении ВКМ, чьи белки, в отличие от клеток, не несут антигенов, вызывающих реакцию отторжения, в силу молекулярного эволюционного консерватизма. В настоящее время в клинике уже активно используются децеллюляризованные кожа, мочевой пузырь, тонкий кишечник и клапаны сердца свиньи, но не хрящевая ткань. Предлагаемый проект призван восполнить этот пробел. Биологические свойства образцов экспериментального клеточного носителя будут изучаться в сравнении с существующим аналогом – микрогетерогенным коллагенсодержащим гидрогелем «Сферогель», хорошо зарекомендовавшем себя в предыдущих работах. Поставленные задачи будут решаться с применением наиболее актуальных современных методов исследования и анализа. Мониторинг жизнеспособности клеток будет проведен методом селективного флуоресцентного окрашивания живых и мёртвых клеток (Live/Dead Assay), оценка пролиферативной активности – методом колориметрического исследования митохондриальных дегидрогеназ (CytoTox Assay), а также путем флуоресцентного измерения количества ядерной ДНК (PicoGreen Assay). Для оценки хондрогенной дифференцировки клеток будут применяться гистохимические методы выявления компонентов межклеточного вещества хрящевой ткани, таких, как кислые гликозаминогликаны и коллаген II типа. Количественная оценка дифференцировки будет проведена путем исследования уровня экспрессии маркерных генов (SOX9, Aggrecan, Collagen II и др.) методом ПЦР в реальном времени. Помимо изучения собственного хондрогенного потенциала МСК будет исследовано влияние на хондрогенез секретируемых ими факторов. Моделью для его оценки in vitro будут служить клеточно-инженерные конструкции на основе первичных хондроцитов и децеллюляризированного хряща, при этом для динамического сокультивирования МСК и хондроцитов будет использован специальный биореактор собственной разработки. Для оценки эффективности создаваемых КИК в качестве средства восстановления суставных дефектов будет использована наиболее подходящая для этих целей in vivo модель, а именно кролики с экспериментальным остеоартрозом. Отсутствие реакции отторжения при ксеногенной трансплантации человеческих клеток животным будет достигнуто путем назначения адекватной иммуносупрессии. После выведения животных из эксперимента будет проведено комплексное гистологическое исследование. В результате будет получен наиболее точный прогноз потенциальной терапевтической эффективности разрабатываемой технологии. Таким образом, в работе будет впервые одновременно исследован хондрогенный потенциал нескольких типов МСК в различных условиях культивирования и разработан новый перспективный подход к их применению в комплексе с новым матриксом-носителем для регенеративной терапии суставных дефектов. При этом уникальная приборно-методическая база обеспечит получение результатов, обладающих высокой степенью научной новизны, а также практической применимостью.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Басок Ю.Б., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Кириллова А.Д., Суббот А.М., Цветкова А.В., Немец Е.А., Севастьянов В.И. Сравнительное исследование хондрогенеза мезенхимальных стромальных клеток жировой ткан и человека при культивировании на коллагенсодержащих носителях в условиях in vitro Вестник трансплантологии и искусственных органов, №3, том 23, стр. 90-100 (год публикации - 2021)
10.15825/1995-1191-2021-3-90-100

2. Немец Е.А., Лажко А.Э., Григорьев А.М., Белов В.Ю., Сургученко В.А., Басок Ю.Б., Кириллова А.Д., Севастьянов В.И. Сверхкритический диоксид углерода как метод снижения цитотоксичности биополимерных и тканеспецифических скаффолдов для тканевой инженерии Вестник трансплантологии и искусственных органов, №2, том 23, стр. 104-113 (год публикации - 2021)
10.15825/1995-1191-2021-2-104-113

3. Севастьянов В.И., Басок Ю.Б., Кирсанова Л.А., Григорьев А.М., Кириллова А.Д., Немец Е.А., Суббот А.М., Готье С.В. A comparison of the capacity of mesenchymal stromal cells for cartilage regeneration depending on collagen-based injectable biomimetic scaffold type Life, Том 11, выпуск 8 (год публикации - 2021)
10.3390/life11080756

4. Кириллова А.Д., Басок Ю.Б., Григорьев А.М.,Кирсанова Л.А.,Немец Е.А., Севастьянов В.И. Cell-engineering structures for regeneration of injured hyaline cartilage International Journal of Artificial Organs, Том 44, №9, стр.633 (год публикации - 2021)
10.1177/03913988211038230

5. Басок Ю.Б., Вахрушев И.В., Григорьев А.М., Цветкова А.В., Кирсанова Л.А., Кириллова А.Д., Немец Е.А., Ярыгин К.Н., Севастьянов В.И. Клеточная терапия поврежденной хрящевой ткани: функциональная эффективность мезенхимальных cтромальных клеток из разных источников V Международный конгресс ассоциации ревмоортопедов: тезисы докладов конгресса, стр.11-13 (год публикации - 2021)

6. Кириллова А.Д., Басок Ю.Б., Духина Г.А., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Олешкевич Д.О., Немец Е.А., Севастьянов В.И. Функциональная эффективность in vitro и in vivo клеточно-инженерных конструкций хряща на основе коллагенсодержащих биомиметиков внеклеточного матрикса Вестник трансплантологии и искусственных органов, №S, том 23, стр. 121 (год публикации - 2021)

7. Вахрушев И.В., Нежурина Е.К., Цветкова А.В., Каралкин П.А., Леонов Г.Е., Буланова Е.А., Хесуани Ю.Д., Миронов В.А., Ярыгин К.Н. In vitro модель ангиогенеза на основе сосудистых органоидов, культивируемых в трехмерных гидрогелях Вестник трансплантологии и искусственных органов, №S, том 23, стр. 119 (год публикации - 2021)

8. Севастьянов В.И., Басок Ю.Б., Григорьев А.М., Немец Е.А., Кириллова А.Д., Кирсанова Л.А., Лажко А.Э., Суббот А., Кравчик М.В., Хесуани Ю.Д., Кудан Е.В., Готьев С.В. Decellularization of cartilage microparticles: Effects of temperature, supercritical carbon dioxide and ultrasound on biochemical, mechanical, and biological properties Journal of Biomedical Materials Research Part A, Vol. 111A, №1, pp. 1-13. (год публикации - 2023)
10.1002/jbm.a.37474

9. Немец Е.А., Лажко А.Э., Григорьев А.М., Басок Ю.Б., Кириллова А.Д., Севастьянов В.И. Биосовместимые и функциональные свойства тканеспецифического мелкодисперсного матрикса из децеллюляризованного хряща свиньи, полученного с применением сверхкритического диоксида углерода Вестник трансплантологии и искусственных органов, Т. 24, № 4, с. 73-84. (год публикации - 2022)
10.15825/1995-1191-2022-4-73-84

10. Басок Ю.Б., Кириллова А.Д., Немец Е.А., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Севастьянов В.И. Development of a tissue equivalent from decellularized porcine articular cartilage The International Journal of Artificial Organs, Vol. 45, №9, p. 785-786. (год публикации - 2022)
10.1177/03913988221117047

11. Басок Ю.Б., Кириллова А.Д., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Севастьянов В.И. Клеточно-инженерные конструкции на основе коллагенсодержащих биомиметиков внеклеточного матрикса для регенерации поврежденного гиалинового хряща III конгресс Ортобиология 2022 «от исследования к клинической практике» : тезисы, С. 57-59. (год публикации - 2022)

12. Басок Ю.Б., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Кириллова А.Д., Севастьянов В.И. A perfusion bioreactor for long-term studies of the dynamics of the formation of a tissue equivalent Biomedical Engineering, Vol. 56, № 4, pp. 221–224. (год публикации - 2022)
10.1007/s10527-022-10206-2

13. Басок Ю.Б., Вахрушев И.В., Григорьев А.М., Цветкова А.В., Кирсанова Л.А., Кириллова А.Д., Немец Е.А., Ярыгин К.Н., Севастьянов В.И. Сравнительный анализ функциональной эффективности мезенхимальных стромальных клеток из разных источников для регенерации хрящевой ткани Тезисы докладов международной научной конференции «Современные проблемы клеточной инженерии, иммунологии и аллергологии», С. 11. (год публикации - 2022)

14. Кириллова А.Д., Басок Ю.Б., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Немец Е.А., Севастьянов В.И. Создание тканевого эквивалента хряща на основе матрицы из децеллюляризованного микронизированного суставного хряща свиньи Гены и клетки, Том XVII, №3, c. 106. (год публикации - 2022)

15. Кириллова А.Д., Басок Ю.Б., Немец Е.А., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Севастьянов В.И. Разработка оптимального протокола децеллюляризации суставного хряща свиньи Вестник трансплантологии и искусственных органов, Т. 24, Приложение, с. 182. (год публикации - 2022)

16. Кириллова А.Д., Немец Е.А., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Рыжикова В.А., Волкова Е.А., Басок Ю.Б., Севастьянов В.И. Влияние трипсина на биохимические и функциональные свойства децеллюляризованного суставного хряща свиньи Вестник трансплантологии и искусственных органов, №3, том 25, стр. 76-86 (год публикации - 2023)
10.15825/1995-1191-2023-3-76-86

17. Басок Ю.Б., Кондратенко А.А., Калюжная Л.И., Волкова Е.А., Воробьев К.А., Севастьянов В.И. Децеллюляризованная строма пуповины в тканевой инженерии и регенеративной медицине: систематический обзор Вестник трансплантологии и искусственных органов, №2, том 25, стр.82-98 (год публикации - 2023)
10.15825/1995-1191-2023-2-82-98

18. Вахрушев И.В., Баскаев К.К., Новикова В.Д., Басок Ю.Б., Севастьянов В.И., Ярыгин К.Н. Экспрессия коллагенов I и II типа мезенхимальными стромальными клетками различного происхождения в процессе хондрогенной дифференцировки Вестник трансплантологии и искусственных органов, Том 25: Приложение, стр.162 (год публикации - 2023)

19. Басок Ю.Б., Вахрушев И.В., Григорьев А.М., Баскаев К.К., Кирсанова Л.А., Кириллова А.Д., Немец Е.А., Ярыгин К.Н., Севастьянов В.И. Пути повышения эффективности клеточной терапии остеоартроза с использованием мезенхимальных стромальных клеток IV конгресс ОРТОБИОЛОГИЯ 2023 "Patient cases - от теории к практике": тезисы, стр. 105-107 (год публикации - 2023)

20. Кириллова А.Д., Басок Ю.Б., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Духина Г.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Севастьянов В.И. Функциональные свойства биомедицинских клеточных продуктов для регенерации поврежденной хрящевой ткани VI Международный конгресс ассоциации ревмоортопедов : Тезисы докладов конгресса, С. 55-57. (год публикации - 2022)

21. Басок Ю., Григорьев А., Кирсанова Л., Кириллова А., Рыжикова В., Суббот А., Немец Е., Севастьянов В. Formation of cartilage-like tissue from collagen-based microparticles in perfusion bioreactor Proceedings of the 16th Sino-Russia Symposium on Advanced Materials and Technologies, Том 16, стр. 145-149 (год публикации - 2023)

22. Белова А.Д., Басок Ю.Б., Григорьев А.М., Кирсанова Л.А., Кузнецова Е.Г., Вахрушев И.В., Ковалев А.В., Ярыгин К.Н., Севастьянов В.И. Оценка действия мезенхимальных стромальных клеток из различных источников на пролиферацию хондроцитов человека Вестник трансплантологии и искусственных органов, Том 25, №4, стр. 121-129 (год публикации - 2023)

Публикации