Модификация нуклеиновых кислот и репарация ДНК как источник новых инструментов управления геномами

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-64-00017

НазваниеМодификация нуклеиновых кислот и репарация ДНК как источник новых инструментов управления геномами

Руководитель Кузнецов Никита Александрович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №56 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова геномное редактирование, CRISPR/Cas9, репарация ДНК, повреждение ДНК, ответ на повреждение ДНК, белок-белковые взаимодействия, белок-нуклеиновые взаимодействия, поли(ADP-рибоза)полимеразы, РНК-связывающие белки, синтез нуклеиновых кислот, белковая инженерия, редакторы оснований, эпигенетические редакторы, направляющие РНК, фосфорилгуанидины

Код ГРНТИ34.15.00, 34.15.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
«Революция геномного редактирования», связанная с появлением системы CRISPR/Cas9, привела к возможности прецизионного изменения генома. Значительное число исследований в мире посвящено поиску способов увеличения эффективности и точности геномного редактирования, а также подходов к регуляции молекулярно-генетических процессов, основанных на комплементарной адресации молекул-эффекторов к определенным последовательностям в геномной ДНК. Популярность системы CRISPR/Cas9 для целей геномного редактирования прежде всего связана с легкостью адресации нуклеазы Cas9 и ее производных к конкретным последовательностям генома. В стандартном варианте применения этой системы для геномного редактирования нуклеаза Cas9, связанная с направляющей РНК, вносит двуцепочечный разрыв в ДНК-мишень, содержащую протоспейсер — участок, одна из цепей которого комплементарна направляющей РНК. После этого разрыв подвергается репарации, которая может протекать либо по одному высокоошибочных путей — негомологичного соединения концов или микрогомологичного соединения концов, либо по точному пути гомологичной рекомбинации. В зависимости от пути репарации могут возникать либо инсерции и делеции, которые, как правило, инактивируют целевой ген, либо точные замены при рекомбинации с молекулой — донором генетического материала. Конкретный путь, по которому идет репарация разрывов, определяется в процессе клеточного ответа на повреждение ДНК — сложного регуляторного пути, в котором принимают участие несколько десятков белков со структурными, сигнальными и каталитическими функциями. Поскольку расщепление целевой ДНК осуществляется одним РНК-адресуемым полипептидом, Сas9 идеально приспособлен для создания модулярных белковых конструкций: он может быть легко адаптирован как платформа для адресации любого другого функционального белка. Получены многочисленные конструкции на архитектуре Cas9 с функциональными модулями для контроля транскрипции на уровне непосредственного взаимодействия с транскрипционными комплексами, эпигенетического метилирования и деметилирования ДНК, конденсации и деконденсации хроматина. Предложены варианты направляющих РНК с дополнительными элементами для сборки мультимодульных конструкций и с модификациями для улучшения функциональности. Созданы варианты геномного редактирования, которые инициируются не двуцепочечным разрывом, а направленной модификацией азотистых оснований (редактирование оснований) либо одноцепочечным разрывом с последующим синтезом ДНК по матрице РНК (прайм-редактирование). Как видно, создание новых и усовершенствование существующих направляющих нуклеиновых кислот и функциональных модулей для использования в адресуемых системах, а также понимание процессов, происходящих в клетках после действия таких систем, представляют собой магистральные пути развития технологий прецизионного управления геномами. Предлагаемый проект направлен на получение новых фундаментальных знаний о механизмах взаимодействия систем геномного редактирования с клетками и на расширение и развитие инструментария для комплементарно адресуемой модификации геномной ДНК. В первом блоке работ будет изучен механизм действия терминальных дезоксирибонуклеотидилтрансфераз (TdT) — ферментов, которые участвуют в репарации двуцепочечных разрывов в ходе V(D)J-рекомбинации и негомологичного соединения концов. На основе этих результатов будет разработана технология химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот, принципиально не ограниченная природой оснований и сахарофосфатного остова. Будут созданы библиотеки канонических и модифицированных 3′-защищенных нуклеозидтрифосфатов. Будут получены и охарактеризованы ферменты TdT из разных биологических видов, и осуществлен дизайн их вариантов, способных эффективно присоединять модифицированные 3′-защищенные нуклеозидтрифосфаты. Во втором блоке работ будет создан ряд репортерных систем для высокопараллельного скрининга активности и специфичности геномных редакторов in vitro, in vivo в клетках бактерий, в клетках человека в культуре. Будет разработана универсальная система для докинга независимо экспрессируемых функциональных модулей на платформе адресующего модуля Cas9. Методы, разработанные в этом блоке, будут далее применены для решения других задач проекта. Третий блок работ посвящен исследованию клеточного ответа на повреждения ДНК, вносимые адресуемыми ферментами геномного редактирования. По отношению к клеткам человека Cas9 и другие CRISPR-ассоциированные белки, используемые в геномном редактировании, биоортогональны — на протяжении всей эволюции молекулярно-генетические системы человека никогда с ними не сталкивались. На сегодня доступно очень мало информации о том, как системы клеточного ответа, оптимизированные для репарации разрывов, вызванных постоянно идущими процессами — спонтанным повреждением ДНК, коллапсом репликативных вилок и т. п. — реагируют на разрывы, вносимые нуклеазой Cas9, и как они взаимодействуют с белками геномного редактирования. В ходе выполнения этого раздела проекта будут исследованы взаимодействия между белками Cas9 и участниками репарации ДНК и ответа на повреждение ДНК — поли(ADP-рибоза)полимеразами PARP1, PARP2, PARP3, Ku-антигеном, ник-сенсором XRCC1 и рядом РНК-связывающих белков, задействованных в ответе на разрывы ДНК. Наконец, четвертый блок работ призван расширить существующий репертуар инструментов управления геномом, построенных на архитектуре Cas9. Будет проведен поиск новых функциональных белковых модулей для направленной модификации ДНК — дезаминирования, окисления, алкилирования, которые могли бы играть роль редакторов оснований для внесения мутаций в геном без образования двуцепочечных разрывов или роль редакторов эпигенетических меток ДНК для направленной регуляции активности генов. Будет исследована эффективность и специфичность редактирования ДНК конструкциями, в которых такие функциональные модули соединены с адресующим модулем Cas9. Кроме того, будет проведено исследование нового класса аналогов направляющих РНК — фосфорилгуанидиновых производных, которые характеризуются частично нейтрализованным зарядом сахарофосфатного остова при полной сохранности комплементарных взаимодействий, что может послужить основой для более специфичной и эффективной адресации.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Красикова Ю.С., Речкунова Н.И., Лаврик О.И. Nucleotide Excision Repair: From Molecular Defects to Neurological Abnormalities International Journal of Molecular Sciences, V. 22, No.12, p. 6220 (год публикации - 2021)
10.3390/ijms22126220

2. Кургина Т.А., Моор Н.А., Кутузов М.М., Науменко К.Н., Украинцев А.А., Лаврик О.И. Dual function of HPF1 in the modulation of PARP1 and PARP2 activities Communications Biology, V. 4, No. 1, p. 1259 (год публикации - 2021)
10.1038/s42003-021-02780-0

3. Бобрикова Е.Н., Чубаров А.С., Дмитриенко Е.В. The Effect of pH and Buffer on Oligonucleotide Affinity for Iron Oxide Nanoparticles Magnetochemistry, 7(9), 128 (год публикации - 2021)
10.3390/magnetochemistry7090128

4. Попова В.К., Полетаева Ю.Е., Пышная И.А., Пышный Д.В., Дмитриенко Е.В. Designing pH-Dependent Systems Based on Nanoscale Calcium Carbonate for the Delivery of an Antitumor Drug Nanomaterials, V. 11., №. 11., P. 2794 (год публикации - 2021)
10.3390/nano11112794

5. Абросимова Л.А., Кузнецов Н.А., Астафурова Н.А., Самсонова А.Р., Карпов А.С., Перевязова Т.А., Оретская Т.С., Федорова О.С., Кубарева Е.А. Kinetic Analysis of the Interaction of Nicking Endonuclease BspD6I with DNA Biomolecules, VТ. 11. – №. 10. – P. 1420. (год публикации - 2021)
10.3390/biom11101420

6. Алемасова Е.Э., Лаврик О.И. A sePARate phase?Poly(ADP-ribose) versus RNA in the organization of biomolecular condensates Nucleic Acids Research, Vol. 50, No. 19, P. 10817–10838 (год публикации - 2022)
10.1093/nar/gkac866

7. Речкунова Н.И., Жданова П.В., Лебедева Н.А., Мальцева Е.А., Коваль В.В., Лаврик О.И. Structural features of DNA polymerases β and λ in complex with benzo[a]pyrene-adducted DNA cause a difference in lesion tolerance DNA Repair (Amst), V. 116, P. 103353 (год публикации - 2022)
10.1016/j.dnarep.2022.103353

8. Алемасова Е.Э., Лаврик О.И. Poly(ADP-ribose) in Condensates: The PARtnership of Phase Separation and Site-Specific Interactions International Journal of Molecular Sciences, V. 23, P. 14075 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms232214075

9. Давлетгильдеева А.Т., Кузнецова А.А., Новопашина Д.С., Ищенко А.А., Сапарбаев М., Федорова О.С., Кузнецов Н.А. Comparative Analysis of Exo- and Endonuclease Activities of APE1-like Enzymes Int. J. Mol. Sci., 23, 2869 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms23052869

10. Сенчурова С.И., Сырямина В.Н., Кузнецова А.А., Новопашина Д.С., Ищенко А.А., Сапарбаев М., Дзюба С.А., Федорова О.С., Кузнецов Н.А. A conserved mechanism of damage recognition by apurinic/apyrimidinic endonucleases from different structural families Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, 1866, 130216 (год публикации - 2022)
10.1016/j.bbagen.2022.130216

11. Кузнецова А.А., Тюгашев Т.Е., Алексеева И.В., Тимофеева Н.А., Федорова О.С., Кузнецов Н.А. Insight into the mechanism of DNA synthesis by human terminal deoxynucleotidyltransferase Life Science Alliance, vol 5, no 12, e202201428 (год публикации - 2022)
10.26508/lsa.202201428

12. Бакман А.С., Ищенко А.А., Сапарбаев М., Федорова О.С., Кузнецов Н.А. Pre-steady-state kinetic and mutational insights into mechanisms of endo- and exonuclease DNA processing by mutant forms of human AP endonuclease Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, 1866, 130198 (год публикации - 2022)
10.1016/j.bbagen.2022.130198

13. Торгашева Н.А., Дятлова Е.А., Грин И.Р., Ендуткин А.В., Мечетин Г.В., Вохтанцев И.П., Юдкина А.В., Жарков Д.О. Noncatalytic domains in DNA glycosylases International Journal of Molecular Sciences, V. 23, No. 13, Article No. 7286 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms23137286

14. Мальцева Е.А., Речкунова Н.И., Лаврик О.И. Non-catalytic domains of DNA polymerase λ: influence on enzyme activity and its regulation Doklady Biochemistry and Biophysics, 512, 245–250. (год публикации - 2023)
10.1134/S1607672923700382

15. Мальцева Е.А., Васильева И.А., Моор Н.А., Ким Д.В., Дырхеева Н.С., Кутузов М.М., Вохтанцев И.П., Кулишова Л.М., Жарков Д.О., Лаврик О.И. Cas9 is mostly orthogonal to human systems of DNA break sensing and repair PlosOne, 18(11):e0294683 (год публикации - 2023)
10.1371/journal.pone.0294683

16. Моор Н.А., Васильева И.А., Лаврик О.И. Human DNA ligases I and IIIα as determinants of accuracy and efficiency of base excision DNA repair Biochimie, S0300-9084(23)00198-0 (год публикации - 2023)
10.1016/j.biochi.2023.08.007

17. Бакман А.С., Кузнецова А.А., Яншоле Л.В., Ищенко А.А., Сапарбаев М., Федорова О.С., Кузнецов Н.А. Fluorescently labeled human apurinic/apyrimidinic endonuclease APE1 reveals effects of DNA polymerase β on the APE1–DNA interaction DNA Repair, 123, 103450 (год публикации - 2023)
10.1016/j.dnarep.2023.103450

18. Дятлова Е.А., Мечетин Г.В., Юдкина А.В., Жарков В.Д., Торгашева Н.А., Ендуткин А.В., Шуленина О.В., Коневега А.Л., Гилева И.П., Щелкунов С.Н., Жарков Д.О. Correlated target search by vaccinia virus uracil–DNA glycosylase, a DNA repair enzyme and a processivity factor of viral replication machinery International Journal of Molecular Sciences, V. 24. – No. 11. – Article No. 9113 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24119113

19. Кулишова Л.М., Вохтанцев И.П., Ким Д.В., Жарков Д.О. Механизмы специфичности системы CRISPR/Cas9 в геномном редактировании Молекулярная биология, Т. 57. – № 2. – С. 269-284 (год публикации - 2023)
10.31857/S0026898423020155

20. Юдкина А.В., Ендуткин А.В., Дятлова Е.А., Жарков Д.О. A non-canonical nucleotide from viral genomes interferes with the oxidative DNA damage repair system DNA Repair, V. 133. – Article No. 103605 (год публикации - 2024)
10.1016/j.dnarep.2023.103605

21. Попова В.К, Дмитриенко Е.В., Чубаров А.С. Magnetic nanocomposites and imprinted polymers for biomedical applications of nucleic acids Magnetochemistry, V. 9. - No. 1. - Article No. 12 (год публикации - 2023)
10.3390/magnetochemistry9010012

22. Васильева С.В., Барановская Е.Е., Дюдеева Е.С., Ломзов А.А., Пышный Д.В. Synthesis of oligonucleotides carrying inter-nucleotide N-(benzoazole)-phosphoramide moieties ACS Omega, V. 8. – No. 1. – P. 1556-1566 (год публикации - 2023)
10.1021/acsomega.2c07083

23. Прохорова Д.В., Вохтанцев И.П., Толстова П.О., Журавлев Е.С., Кулишова Л.М., Жарков Д.О., Степанов Г.А. Natural Nucleoside Modifications in Guide RNAs Can Modulate the Activity of the CRISPR-Cas9 System In Vitro The CRISPR Journal, Vol. 5, № 6, P. 799-812. (год публикации - 2023)
10.1089/crispr.2022.0069

24. Прохорова Д.В., Матвеева А.М., Закабунин А.И., Рябченко А.В., Степанов Г.А. Influence of N1-Methylpseudouridine in Guide RNAs on CRISPR/Cas9 Activity International Journal of Molecular Sciences, V. 24. № 23. 17116. (год публикации - 2023)
10.3390/ijms242317116

25. Васильева С.В., Кузнецова А.А., Барановская Е.В., Кузнецов Н.А., Ломзов А.А., Пышный Д.В. Synthesis of the new nucleoside 5′-alpha-iminophosphates using Staudinger reaction Bioorganic Chemistry, 127, 105987 (год публикации - 2022)
10.1016/j.bioorg.2022.105987

26. Бауэр И.А., Дмитриенко Е.В. Amphiphilic Oligonucleotide Derivatives—Promising Tools for Therapeutics Pharmaceutics, Pharmaceutics 2024, 16(11), 1447; https://doi.org/10.3390/pharmaceutics16111447 (год публикации - 2024)
10.3390/pharmaceutics16111447

27. Малова (Козырева) Е.А., Пышная И.А., Мещанинова М.И., Пышный Д.В. Adaptation of the Protocol of the Automated Solid-Phase Phosphoramidite Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides for Preparing Their N-Unsubstituted Phosphoramidate Analogs (P–NH2) Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2024, Vol. 50, No. 6, pp. 1–18. (год публикации - 2024)
10.1134/S106816202406027X

28. Прохорова Д.В., Купрюшкин М.С., Жуков С.А., Жарков Т.Д., Довыденко И.С.,Яковлева К.И., Переверзев И.М., Матвеева А.М., Пышный Д.В., Степанов Г.А. Effect of the Phosphoryl Guanidine Modification in Chimeric DNA–RNA crRNAs on the Activity of the CRISPR-Cas9 System In Vitro ACS Chemical Biology, ACS Chemical Biology 2024 19 (6), 1311-1319 (год публикации - 2024)
10.1021/acschembio.4c00147

29. Лебедева Н.А., Дырхеева Н.С., Речкунова Н.И., Лаврик О.И. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 has major impact in prevention of suicidal covalent DNA-protein crosslink with apurinic/apyrimidinic site in cellular extracts IUBMB Life, 76(11):987-996 (год публикации - 2024)
10.1002/iub.2890

30. Новгородцева А.И., Ломзов А.А., Васильева С.В. Synthesis and Properties of α-Phosphate-Modified Nucleoside Triphosphates Molecules, Molecules 2024, 29(17), 4121; https://doi.org/10.3390/molecules29174121 (год публикации - 2024)
10.3390/molecules29174121

31. Кузнецова А.А., Сенчурова С.И., Гаврилова А.А., Тюгашев Т.Е., Микушина Е.С., Кузнецов Н.А. Substrate Specificity Diversity of Human Terminal Deoxynucleotidyltransferase May Be a Naturally Programmed Feature Facilitating Its Biological Function Int. J. Mol. Sci., Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 879. (год публикации - 2024)
10.3390/ijms25020879

32. Красикова Ю.С., Мальцева Е.А., Ходырева С.Н., Евдокимов А.Н., Речкунова Н.И., Лаврик О.И. Does the XPA-FEN1 Interaction Concern to Nucleotide Excision Repair or Beyond? Biomolecules, 14(7):814 (год публикации - 2024)
10.3390/biom14070814

33. Ходырева С.Н., Ильина Е.С., Дырхеева Н.С., Кочеткова А.С., Ямских А.А., Мальцева Е.А., Малахова А.А., Медведев С.П., Закиян С.М., Лаврик О.И. A Knockout of Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1 in a Human Cell Line: An Influence on Base Excision Repair Reactions in Cellular Extracts Cells, 13(4):302 (год публикации - 2024)
10.3390/cells13040302

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
«Революция геномного редактирования», связанная с появлением системы CRISPR/Cas9, привела к возможности прецизионного изменения генома. Значительное число исследований в мире посвящено поиску способов увеличения эффективности и точности геномного редактирования, а также подходов к регуляции молекулярно-генетических процессов, основанных на комплементарной адресации молекул-эффекторов к определенным последовательностям в геномной ДНК. Популярность системы CRISPR/Cas9 для целей геномного редактирования прежде всего связана с легкостью адресации нуклеазы Cas9 и ее производных к конкретным последовательностям генома. В стандартном варианте редактирования нуклеаза Cas9, связанная с направляющей РНК, вносит двуцепочечный разрыв в ДНК-мишень, содержащую протоспейсер – участок, одна из цепей которого комплементарна направляющей РНК. После этого разрыв подвергается репарации либо по одному из высокоошибочных путей – негомологичного соединения концов или микрогомологичного соединения концов, либо по точному пути гомологичной рекомбинации. В зависимости от пути репарации могут возникать либо инсерции и делеции, которые, как правило, инактивируют целевой ген, либо точные замены при рекомбинации с молекулой – донором генетического материала. Конкретный путь, по которому идет репарация разрывов, определяется в процессе клеточного ответа на повреждение ДНК – сложного регуляторного пути, в котором принимают участие несколько десятков белков со структурными, сигнальными и каталитическими функциями. Поскольку расщепление целевой ДНК осуществляется одним РНК-адресуемым полипептидом, Сas9 идеально приспособлен для создания модулярных белковых конструкций: он может быть легко адаптирован как платформа для адресации любого другого функционального белка для контроля транскрипции, эпигенетического метилирования и деметилирования ДНК, конденсации и деконденсации хроматина. Созданы варианты геномного редактирования, которые инициируются не двуцепочечным разрывом, а направленной модификацией азотистых оснований (редактирование оснований) либо одноцепочечным разрывом с последующим синтезом ДНК по матрице РНК (прайм-редактирование). Проект направлен на получение новых фундаментальных знаний о механизмах взаимодействия систем геномного редактирования с клетками и на расширение и развитие инструментария для комплементарно адресуемой модификации геномной ДНК. В ходе проекта решаются 4 блока взаимодополняющих задач. В первом блоке работ изучается механизм действия терминальных дезоксирибонуклеотидилтрансфераз (TdT) с конечной целью разработки технологии химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот, принципиально не ограниченной природой оснований и сахарофосфатного остова. В отчетном году проведен экспериментальный анализ ряда мутантных вариантов TdT человека, содержащих замены аминокислотных остатков, обеспечивающих связывание ДНК-праймера и/или dNTP, изменение специфичности TdT по отношению к природным dNTP, влияющих на конформационную подвижность ДНК-связывающего центра и потенциально повышающих термостабильность фермента. Получен вариант, обладающий наибольшей термостабильностью при сохранении высокой активности. Проведено моделирование мутантных и химерных вариантов ДНК-полимераз семейства PolX из нескольких термофильных микроорганизмов, потенциально обладающих способностью проводить «матрица-независимый» синтез и с использованием полученных данных предложены варианты, потенциально обладающие активностью TdT. Проведено исследование методов отщепления фосфоримидазольной группы концевого межнуклеотидного фосфата, блокирующей рост цепи, для возвращения субстратных свойств при пошаговом синтезе ДНК при помощи TdT. Создан набор ферментов нуклеозид- и нуклеотидкиназ, входящих в каскад синтеза dNTP, для синтеза α-модифицированных dNTP, предложены мутантные варианты нуклеозидкиназ с расширенным спектром субстратной специфичности. Во втором блоке работ создаются репортерные системы для скрининга активности и точности геномных редакторов. В отчетном году проведены исследования двух разработанных в ходе проекта систем, основанных на инактивации гена каталитической субъединицы фосфатидилинозитол-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (PIGA) человека и гена β-субъединицы РНК-полимеразы (rpoB) E. coli. Показано, что система PIGA может быть использована для быстрого фенотипического скрининга эффективности систем геномного редактирования в клетках человека стандартными методами проточной цитофлуориметрии. Показано, что система rpoB может быть использована для быстрого фенотипического скрининга точности систем геномного редактирования в клетках E. coli. Третий блок работ посвящен исследованию клеточного ответа на повреждения ДНК, вносимые адресуемыми ферментами геномного редактирования. В отчетном году при помощи системы CRISPR/Cas9 получены линии клеток человека с нокаутом генов PARP1, TDP1, YB-1 и HPF1. Показано, что нокаут PARP1 практически полностью подавляет синтез поли(АДФ-рибозы), но существенно не влияет на экспрессию прочих ключевых факторов система эксцизионной репарации оснований ДНК — урацил-ДНК-гликозилазы (UNG), апурин-апиримидиновой эндонуклеазы (APE1), ДНК-полимеразы β, ДНК-лигазы III, адапторного белка XRCC1 и поли(АДФ-рибоза)полимеразы 2 (PARP2). Показано образование суицидальных ДНК-белковых сшивок белков PARP1, OGG1, PARP2 и XRCC1 при взаимодействии с ДНК, содержащей апурин-апиримидиновые (АП-) сайты. Установлено, что тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 (TDP1) способна расщеплять такие сшивки, образованные OGG1 и PARP2, но не PARP1 и XRCC1. Однако ключевым фактором в предотвращении суицидальных сшивок является фермент АРЕ1, который расщепляет АП-сайты в ДНК. В клетках, нокаутных по гену APE1, уровень таких сшивок повышен. Наконец, четвертый блок работ призван расширить существующий репертуар инструментов управления геномом, построенных на архитектуре Cas9. В отчетном году исследованы свойства конструкций, содержащих мутантные варианты урацил-ДНК-гликозилазы человека UNG-Y147A или UNG-N204D, ДНК-полимеразу X вируса африканской чумы свиней, эндонуклеазу V (Nfi) и эпистатическую к ней 3′→5′-экзонуклеазу TatD. Реконструирован из рекомбинантных белков путь репарации гипоксантина в E. coli с участием Nfi, TatD и ДНК-полимеразы I. Обнаружен вариант UNG с заменой L272F, обладающий повышенной активностью в отношении одноцепочечных ДНК-субстратов, что делает его привлекательным кандидатом для использования в гликозилазных редакторах оснований. Клонирована и охарактеризована обратная транскриптаза из интрона группы II бактерии Eubacterium rectale для использования в прайм-редактировании. Показано эффективное редактирование генома в клетках человека в культуре предсобранными рибонуклеопротеиновыми комплексами Cas9 с направляющими РНК, модифицированными фосфорилгуанидиновыми группами.

Публикации

Возможность практического использования результатов
В ходе проекта разработаны несколько технологий, которые имеют возможность войти в стандартный инструментарий работ в области геномной инженерии и синтетической биологии и обладают значительным потенциалом коммерциализации. Во-первых, это технология химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот, принципиально не ограниченная природой оснований и сахарофосфатного остова. Такие технологии в настоящее время рассматриваются как альтернатива традиционному химическому синтезу, имеет потенциал превзойти его в точности и способности получать разнообразные функционализированные олиго- и полинуклеотиды. Области применения синтетических нуклеиновых кислот обширны — это прежде всего медицинская диагностика и терапия, но также и синтетическая биология, и новые способы записи и хранения цифровой информации. В ходе выполнения проекта заложены основы такой технологии, которая при надлежащей оптимизации и доводке до производственных стандартов найдет свое применение во всех этих сферах. Во-вторых, обнаружен ряд новых функциональных модулей и направляющих нуклеиновых кислот для геномных редакторов, которые сами по себе, либо их производные при дальнейшей разработке, могут получить патентную защиту. Это позволит облегчить выполнение и расширить круг возможных операций по изменению генома человека, сельскохозяйственных животных и растений, биотехнологических продуцентов. Новые инструменты редактирования генома, полученные в ходе проекта, представляют значительную ценность для зарождающегося сектора биоэкономики РФ, использующего современные генетические технологии.