Второй этап развития оптогенетики: новые подходы для исследований и медицины

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-64-00018

НазваниеВторой этап развития оптогенетики: новые подходы для исследований и медицины

Руководитель Борщевский Валентин Иванович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" , г Москва

Конкурс №56 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые слова Генетика, оптогенетика, метагеномика, анализ геномов, родопсины, LOV домены, возбуждающие переносчики аминокислот, рецепторы связанные с G-белком, контроль органелл, фотоконвертируемые лиганды, структурная биология мембранных белков

Код ГРНТИ34.17.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Открытие оптогенетических инструментов первого поколения представило принципиально новый метод для современных наук о жизни. Это открытие является выдающимся примером того, как фундаментальные исследования генетических манипуляций на клетках могут перерасти в практические приложения в клеточных системах и животных. Оптогенетика уже оказала огромное влияние на нейронауки. До сих пор, однако, воздействие было в основном связано использованием светочувствительных ионных каналов, что ограничивало его применение стимуляцией нервных клеток. Это мешало широкому применению технологии в биологических науках и медицине. Целью настоящего проекта является принципиальное усиление возможностей оптогенетики посредством генетических манипуляций, позволяющих выполнять оптический контроль сигнальных, биоэнергетических и метаболических путей клеток, клеточных органелл и систем животных для исследовательских и медицинских целей. Эти цели будут достигнуты при помощи: 1) Расширения набора инструментов для оптогенетики с помощью биоинформатики и метагеномики путем поиска генов, кодирующих фотоактивные белки, которые могут иметь новые свойства, подходящие для оптогенетики - далее будет называться “Поиск генов для оптогенетического инструментария 2.0” ; 2) Экспериментальное описание и выбор наилучших оптогенетических инструментов, кодируемых заранее выбранными генами - далее будет называться “Характеризация оптогенетического инструментария 2.0” ; 3) Разработка генетических подходов, включая дизайн выбранных генов, обеспечивающих направленную экспрессию соответствующих белков в мембранах клеток и их органеллах - далее будет называться “Направленная экспрессия оптогенетического инструментария 2.0” 4) Разработка генов химер светочувствительных белков с различными интересующими белками - “Расширение оптогенетического инструментария 2.0” -- GPCRs - далее будут называться “optoGPCRs” -- Ионные переносчики - далее будут называться “optoTransporters” -- Малые ГТФазы (белки Arf и Ras) - далее будут называться “optoArf и optoRas” -- рецепторные киназы - далее будут называться “optoKinases” -- бактериальные люциферазы - далее будут называться “Bactoluminopsin” 5) Структурные исследования оптогенетических белков для понимания механизма их функции и структурная инженерия усовершенствованных оптогенетических инструментов - далее будет называться “Оптимизация оптогенетического инструментария 2.0 на основе структурных данных” 6) Применение разработанных инструментов и подходов для управления клетками -далее будет называться “Исследование оптогенетического инструментария 2.0 в клетках”

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Гончаров И.М., Смоленцева А., Семёнов О., Натаров И., Назаренко В.В., Юденко А., Ремеева А., Гущин И. High-resolution structure of a naturally red-shifted LOV domain Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 567, 27 August 2021, Pages 143-147 (год публикации - 2021)
10.1016/j.bbrc.2021.06.046

2. Забельский Д., Дмитриева Н., Волков О., Шевченко В. Structure-based insights into evolution of rhodopsins Communications Biology, volume 4, issue 1, pages 1-12 (год публикации - 2021)
10.1038/s42003-021-02326-4

3. Харо-Морено Х., Лопез-Перез М., Родригез-Валера Ф. Enhanced Recovery of Microbial Genes and Genomes From a Marine Water Column Using Long-Read Metagenomics frontiers in microbiology, volume 12, pages 2410 (год публикации - 2021)
10.3389/fmicb.2021.708782

4. Смоленцева А., Гончаров И.М., Юденко А., Богородский А., Семёнов О., Назаренко В.В., Борщевский В., Фонин А.В., Ремеева А., Егер К.-Э., Краусс У., Горделий В., Гущин И. Extreme dependence of Chloroflexus aggregans LOV domain thermo- and photostability on the bound flavin species Photochemical & Photobiological Sciences, Photochem Photobiol Sci 20, 1645–1656 (год публикации - 2021)
10.1007/s43630-021-00138-3

5. Соловьёв Д., Борщевский В.И., Чижов И.В. Time-resolved UV-VIS spectroscopy of microbial rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 169 - 179 (год публикации - 2022)
10.1007/978-1-0716-2329-9_8

6. Борщевский В.И., Ковалёв К.В., Раунд А., Ефремов Р., Асташкин Р., Буренков Г., Братанов Д., Баландин Т., Чижов И.В., Баекен К., Гущин И.Ю., Кузьмин А.С., Алексеев А.А., Рогачев А.В., Вильбольд Д., Энгельгард М., Эрнст Б., Бюльдт Г., Горделий В.И. True-atomic-resolution insights into the structure and functional role of linear chains and low-barrier hydrogen bonds in proteins Nature Structural & Molecular Biology, Том 29, Выпуск 5, Страницы 440 - 450 (год публикации - 2022)
10.1038/s41594-022-00762-2

7. Муругова Т.Н., Иванков О.И., Рижиков Ю.Л., Соловьёв Д., Ковалёв К.В., Скачкова Д.В., Раунд А., Баекен К., Ищенко А.В., Волков Д., Рогачев А.В., Власов А.В., Куклин А.И., Горделий В.И. Mechanisms of membrane protein crystallization in ‘bicelles’ Scientific Reports, Том 12, Выпуск 1 (год публикации - 2022)
10.1038/s41598-022-13945-0

8. Горделий В.И., Ковалёв К.В., Эрнст Б., Родригес-Валера Ф., Зиновьев Е.В., Забельский Д.В., Алексеев А.А., Росселли Р., Гущин И.Ю., Охрименко И.С. Microbial Rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 1 - 5 (год публикации - 2022)
10.1007/978-1-0716-2329-9_1

9. Алексеев А.А., Горделий В.И., Эрнст Б. Rhodopsin-Based Optogenetics: Basics and Applications Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 71 - 100 (год публикации - 2022)
10.1007/978-1-0716-2329-9_3

10. Баландин Т., Волков Д., Алексеев А.А., Ковалёв К.В., Братанов Д. E. coli expression and purification of microbial and viral rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 109 - 124 (год публикации - 2022)
10.1007/978-1-0716-2329-9_5

11. Горделий В.И., Ковалёв К.В., Асташкин Р., Горделий В.И., Черезов В.Г. Crystallization of Microbial Rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 125 - 146 (год публикации - 2022)
10.1007/978-1-0716-2329-9_6

12. Рокицкая Т.И., Маляр Н., Силецкий С.А., Горделий В.И., Антоненко Ю.Н. Electrophysiological Characterization of Microbial Rhodopsin Transport Properties: Electrometric and ΔpH Measurements Using Planar Lipid Bilayer, Collodion Film, and Fluorescent Probe Approaches Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 259 - 275 (год публикации - 2022)
10.1007/978-1-0716-2329-9_12

13. Ремеева А.А., Юденко А.Н., Назаренко В.В., Семенов О.Ю., Смоленцева А.А., Богородский А.О., Маслов И.В., Борщевский В.И., Гущин И.Ю. Development and Characterization of Flavin-Binding Fluorescent Proteins, Part I: Basic Characterization Methods in Molecular Biology, Том 2564, Страницы 121 - 141 (год публикации - 2023)
10.1007/978-1-0716-2667-2_6

14. Асташкин Р., Ковалёв К.В., Бухдрукер С., Ваганова С., Кузьмин А.С., Алексеев А.А., Баландин Т., Забельский Д.В., Гущин И.Ю., Роянт А., Волков Д., Буренков Г., Кунин Е., Энгельгард М., Эрнст Б., Горделий В.И. Structural insights into light-driven anion pumping in cyanobacteria Nature Communications, Том 13, Выпуск 1 (год публикации - 2022)
10.1038/s41467-022-34019-9

15. Родригес-Валера Ф., Пушкарев А., Росселли Р., Бежа О. Searching Metagenomes for New Rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 101 - 108 (год публикации - 2022)
10.1007/978-1-0716-2329-9_4

16. Мельников И., Орехов Ф., Рулев М., Ковалёв К.В., Асташкин Р., Братанов Д., Рижиков Ю.Л., Баландин Т., Бухдрукер С., Охрименко И.С., Борщевский В.И., Буренков Г., Мюллер-Дикманн К., Ван дер Линден П., Карпентиер Ф., Леонард Г., Горделий В.И., Попов А. High-pressure crystallography shows noble gas intervention into protein-lipid interaction and suggests a model for anaesthetic action Communications Biology, Том 5, Порядковый номер 360 (год публикации - 2022)
10.1038/s42003-022-03233-y

17. Николаев А., Юденко А.Н., Смоленцева А.А., Богородский А.О., Цыбров Ф.М., Борщевский В.И., Бухалович С.М., Назаренко В.В., Кузнецова Е.А., Семенов О.Ю., Ремеева А.А., Гущин И.Ю. Fine spectral tuning of a flavin-binding fluorescent protein for multicolor imaging Journal of Biological Chemistry, Том 299, выпуск 3 (год публикации - 2023)
10.1016/j.jbc.2023.102977

18. Фомин В.В., Баженов С.В., Конончук О.В., Матвеева В.О., Зарубина А.П., Спиридонов С.Е., Манухов И.В. Photorhabdus lux-operon heatshock-like regulation Heliyon, Том 9, выпуск 3 (год публикации - 2023)
10.1016/j.heliyon.2023.e14527

19. Ковалёв К.В., Цыбров Ф.М., Алексеев А.А., Горделий В.И. Mechanisms of inward transmembrane proton translocation Nature Structural & Molecular Biology, Том 30 (год публикации - 2023)
10.1038/s41594-023-01020-9

20. Охрименко И.С., Ковалёв К.В., Петровская Л.Е., Ильинский Н.C., Алексеев А.А., Марьин Е., Рокицкая Т.И., Антоненко Ю.Н., Силецкий С.А., Попов А., Загрядская Ю.А., Соловьёв Д., Чижов И.В., Забельский Д.В., Рижиков Ю.Л., Власов А.В., Куклин А.И., Богородски Mirror proteorhodopsins Communications Chemistry, Том 6 (год публикации - 2023)
10.1038/s42004-023-00884-8

21. Власова А.Д., Полякова А., Громова А., Долотова С., Бухалович С.М., Багаева Д., Богородский А.О., Цыбров Ф.М., Ковалёв К.В., Михайлов А.Э., Сидоров Д.В., Богородский А.О., Ильинский Н.C., Куклин А.И., Власов А.В., Борщевский В.И., Иванович В. Optogenetic cytosol acidification of mammalian cells using an inward proton-pumping rhodopsin International Journal of Biological Macromolecules, Том 242, часть 3 (год публикации - 2023)
10.1016/j.ijbiomac.2023.124949

22. Лиу Х., Лиу В.В., Харо-Морено Х.М., Xу Б., Женг Я., Лиу Й., Тиан Й., Жанг X.Х., Жоу Н.Ю., КЬЮин Л., Жу Ю., Родригес-Валера Ф., Жанг Ч. A moderately thermophilic origin of a novel family of marine group II euryarchaeota from deep ocean iScience, Том 26, Выпуск 9 (год публикации - 2023)
10.1016/j.isci.2023.107664

23. Рокицкая Т.И., Алексеев А.А., Цыбров Ф.М., Бухалович С.М., Антоненко Ю.Н., Горделий В.И. Retinal-Based Anion Pump from the Cyanobacterium Tolypothrix campylonemoides Biochemistry Moscow, Том 88 (год публикации - 2023)
10.1134/S0006297923100127

24. Николаев А., Тропина Е.В., Болдырев К.Н., Максимов Е.Г., Борщевский В.И., Мишин А.В., Юденко А.Н., Кузьмин А.С., Кузнецова Е.А., Семенов О.Ю., Ремеева А.А., Гущин И.Ю. Two distinct mechanisms of flavoprotein spectral tuning revealed by low-temperature and time-dependent spectroscopy Protein Science, e4851 (год публикации - 2023)
10.1002/pro.4851

25. Власова А.Д., Бухалович С.М., Багаева Д.Ф., Полякова А.П., Ильинский Н.С., Нестеров С.В., Цыбров Ф.М., Богородский А.О., Зиновьев Е.В., Михайлов А.Е., Власов А.В., Куклин А.И., Борщевский В.И., Бамберг Э., Уверский В.Н., Горделий В.И. Intracellular microbial rhodopsin-based optogenetics to control metabolism and cell signaling Chemical Society Reviews, Chem. Soc. Rev., 2024,53, 3327-3349 (год публикации - 2024)
10.1039/D3CS00699A

26. Юденко А., Баженов С.В., Алексенко В.А., Гончаров И.М., Семёнов О., Ремеева А., Назаренко В.В., Кузнецова Е., Фомин В.В., Коноплева М.Н., Аль Эбрахим Р., Случанко Н.Н., Ржийкау Ю., Семёнов Ю.С., Куклин А., Манухов И.В., Гущин И. luxA Gene From Enhygromyxa salina Encodes a Functional Homodimeric Luciferase PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 92, Issue 12 (год публикации - 2024)
10.1002/prot.26739

27. Корнилов Д., Бухдрукер С., Цыбров Ф., Чижов И., Голубев В., Кузьмичев П., Власов А., Уверский В., Горделий В. Production of eukaryotic heliorhodopsins for structural analysis utilizing the LEXSY expression system International Journal of Biological Macromolecules, Volume 283, Part 1, 137324 (год публикации - 2024)
10.1016/j.ijbiomac.2024.137324

28. Николаев А., Кузьмин А., Маркеева Е., Кузнецова Е., Рижиков Ю.Л., Семёнов О., Анучина А., Ремеева А., Гущин И. Reengineering of a flavin-binding fluorescent protein using ProteinMPNN Protein Science, Volume 33, Issue 4 (год публикации - 2024)
10.1002/pro.4958

29. Забельский Д., Бухдрукер С., Бухалович С., Цыбров Ф., Ламм Г.Х.У., Асташкин Р., Дорогинин Д., Матвеев Г., Сударев В., Кузьмин А., Зиновьев Е., Власова А., Рыжикау Ю., Ильинский Н., Гущин И., Буренков Г., Алексеев А., Раунд А., Вахтвейтль Й., Бамберг Э., Горделий В. Ion conducting and gating molecular mechanisms of channelrhodopsin revealed by true-atomic resolution structures of open and closed states Nature Structural & Molecular Biology (год публикации - 2024)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В рамках работы над проектом по созданию, характеризации и применению новых оптогенетических инструментов в 2024 году нами были выполнены следующие работы. В ходе поиска генов для оптогенетического инструментария в текущем отчётном периоде нами были проведены классификация и анализ генов микробных родопсинов из трёх природных окружений разного уровня солёности. Кроме того, были обнаружены и классифицированы гены гелиородопсинов, которые не содержат лизин, ковалентно связывающий кофактор ретиналь. Среди этих генов представители пяти групп выбраны как наиболее перспективные для дальнейших экспериментальных исследований. Получены важные результаты для искусственно сконструированных аналогов природных белков. Показано, что созданные при помощи нейронных сетей MPNN (message passing neural network) варианты CagFbFP, названные NeuroFbFP, стабильны, связывают флавины в качестве хромофоров и имеют оптические свойства, сходные с природным белком, несмотря на замену 36-48% аминокислот (Nikolaev et al., 2024a). Показано, что созданные при помощи нейронных сетей растворимые аналоги мембранного насоса бактериородопсина, являющегося прототипическим микробным родопсином, мономерны и стабильны, могут связывать ретиналь и фотоциклировать (препринт Nikolaev et al., 2024b). Достигнуто встраивание в лизосомные мембраны клеток HEK293T новых родопсинов LxXeR, BcXeR. Показано наличие изменения лизосомного pH от освещения lyso-BcXeR, lyso-LxXeR. Результаты повышения pH с помощью световой активации lyso-LxXeR сравнимы с ранее описанным нами родопсином lyso-NsXeR, то есть новые родопсины перспективны для применения в различных клеточных приложениях, в том числе связанных с лизосомами. Показано значительное, сравнимое с химической индукцией, воздействие на цитозольный кальций различными рассмотренными родопсинами при их нахождении в клеточной мембране. Получены результаты экспериментов по подбору кристаллизационных условий для комплекса целевой GPCR - фотопереключаемый лиганд. Проведены рентгеноструктурные испытания кристаллов на микрофокусной станции синхротронного излучения. Также получены данные об экспрессии целевых рецепторов в клетках HEK293T, что создаёт основу для последующих функциональных тестов. Разработанные нами генетические конструкции фотоактивируемых тирозинкиназных рецепторов HER1, HER2, на основе светочувствительного домена CRY2 и PhyB были использованы для трансфекции клеток млекопитающих с целью изучения их экспрессии, субклеточной локализации, а впоследствии проведения функциональных исследований, механизмов активации и передачи сигналов внутрь клетки. Уровень трансфекции генов в клетках HEK293 составил 40-60%, однако на данный момент экспрессия недостаточна для постановки экспериментов по изучению локализации и функциональной активности конфокальной микроскопией. Необходимо дальнейшая оптимизация генетических конструкций и протоколов экспрессии с целью получения стабильного функционально-активного белка в количествах, достаточных для проведения структурно-функциональных исследований. Было проведено исследование сконструированного на предыдущем этапе химерного белка, состоящего из слитых бактериальной люциферазы и ксантородопсина XR3, отличающегося наличием дополнительной светоулавливающей антенны. Изменение спектра люминесценции клеток с гибридными белками подтвердило способность родопсина улавливать свет от пришитой к нему люциферазы, при этом заметно положительное влияние наличия дополнительной антенны. Однако функциональные исследования показали, что ни новая белковая конструкция, ни ранее созданные конструкции с другими родопсиновыми протонными помпами не обладали достаточной активностью для изменения и поддержания мембранного потенциала в клетках. По всей видимости, активности бактериальной люциферазы недостаточно для эффективной работы родопсиновых помп и достижения существенных изменений концентраций протонов по разные стороны клеточной мембраны. В результате выполнения проекта достигнута возможность оптогенетического изменения рН цитозоля с помощью ряда родопсинов-протонных помп с разными свойствами, а также измерения этих изменений при помощи отличающихся по спектральным свойствам флуоресцентных сенсоров. Помимо этого, показано влияние оптогенетического закисления цитозоля на биоэнергетические, метаболические и сигнальные процессы в клетке. Сигнальные процессы активируются, т.к. показаны выброс кальция в цитозоль и генерация АФК при оптогенетическом защелачивании цитозоля клеток человека. Оптогенетическое защелачивание цитозоля также исчерпывает биоэнергетику и смещают метаболизм в сторону катаболизма, поскольку снижается концентрация АТФ. Результаты проекта опубликованы в 5 статьях, в том числе в высокоуровневых журналах первого квартиля (Q1), таких как Nature Structural & Molecular Biology.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Разработка новой продукции: создание инновационных медицинских устройств и технологий для неинвазивного управления клеточной активностью с применением оптогенетики. Совершенствование технологий: интеграция оптогенетических подходов в существующие методы регенеративной медицины и биофармацевтического производства. Усовершенствование услуг: повышение качества реабилитационных программ в неврологии и психиатрии за счет применения целевых терапевтических оптогенетических методов.