Создание с использованием генетических технологий и изучение новых линий растений, адаптированных к меняющимся условиям окружающей среды, обладающих повышенной продуктивностью и диетической ценностью

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-66-00012

НазваниеСоздание с использованием генетических технологий и изучение новых линий растений, адаптированных к меняющимся условиям окружающей среды, обладающих повышенной продуктивностью и диетической ценностью

Руководитель Хлесткина Елена Константиновна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н. И. Вавилова" , г Санкт-Петербург

Конкурс №56 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые слова CRISPR/Cas, биологически активные компоненты, гены-мишени, диетическое питание, зернобобовые, зерновые, овощные, плодовые, продуктивность, редактированные линии, устойчивость

Код ГРНТИ62.37.29

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Выполнение предполагаемого проекта планируется в рамках научного приоритета Н2-1. «Разработка генетических технологий, применяемых в растениеводстве» Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019-2027 годы. Реализация запланированных в проекте масштабных комплексных исследований на широком спектре культурных растений будут способствовать решению приоритетной задачи Н2-1-1. Получение новых линий растений с повышенной устойчивостью к болезням и вредителям, гербицидам, сложным климатическим условиям, обладающих улучшенной пищевой и технологической ценностью, увеличенным сроком хранения продукции. Актуальность проекта состоит в том, что он направлен на преодоление сразу нескольких ограничительных факторов (узкий спектр доступных генов-мишеней для улучшения генотипов путем редактирования, видо- и генотипспецифическая зависимость эффективности трансформации и регенерации, недостаточная изученность плейотропного действия нокаута многих генов), тормозящих широкое использование генетических технологий в растениеводстве. Проект охватывает более 10 культур (ячмень, кукуруза, чуфа, соя, горох, свекла, редис, арбуз, киви, виноград и др.) и предполагает получение модифицированных линий с улучшенным биохимическим составом семян, плодов или корнеплодов в ответ требованиям рынка диетического и функционального питания и в целом требованиям современной пищевой промышленности. Также осуществленные разработки позволят в дальнейшем рационально менять габитус растений, контролировать форму и размер плодов, увеличивать продуктивность, диверсифицировать сорта по срокам спелости в ответ на требования к конвейерному типу производства определенных культур и для повышения адаптации к неблагоприятным условиям среды. На основе разных подходов к расширению спектра редактируемых генотипов и преодолению генотип-специфической низкой эффективности трансформации и регенерации, будет предложена стратегия для доступного редактирования широкого набора сортов, в частности, для зерновых и зернобобовых культур. В проекте охватываются как новые в плане редактирования культуры, так и новые гены-мишени а также генотипы, впервые вовлекаемые в генно-инженерные исследования. Его успешное выполнение заложит фундамент для масштабирования подобных работ в объеме требований современной селекции.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Разгонова М.П., Захаренко А.М., Гордеева Е.И., Шоева О.Ю., Антонова Е.В., Пикула К.С., Коваль Л.А., Хлесткина Е.К., Голохваст К.С. Phytochemical Analysis of Phenolics, Sterols, and Terpenes in Colored Wheat Grains by Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry Molecules, выпуск 26, онлайн номер статьи 5580 (год публикации - 2021)
10.3390/molecules26185580

2. Лебедева М.А., Mahboobeh А., Садикова Д.С., Лутова Л.А. At the root of nodule organogenesis: conserved regulatory pathways recruited by rhizobia Plants, Plants 2021, 10(12), 2654 (год публикации - 2021)
10.3390/plants10122654

3. Беспалова Е.С., Ершова К.М., Ухатова Ю.В. Регенерация сои в культуре in vitro (обзор). Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 2021;182(4):148-155 (год публикации - 2021)
10.30901/2227-8834-2021-4-148-155

4. Соколова, Д.В.; Швачко, Н.А.; Михайлова, А.С.; Попов, В.С. Betalain content and morphological characteristics of table beet accessions: their interplay with abiotic factors Agronomy, Agronomy 2022 , 12 (5), 1033; https://doi.org/10.3390/agronomy12051033 (год публикации - 2022)
10.3390/agronomy12051033

5. Лебедева М.А.; Садикова Д.С.; Добычкина Д.А.; Жуков В.А.; Лутова Л.А. CLAVATA3/EMBRYO surrounding region genes involved in symbiotic nodulation in Pisum sativum Agronomy, 2022, 12, 2840 (год публикации - 2022)
10.3390/agronomy12112840

6. Антонова Е. В., Шималина Н. С., Короткова А. М., Колосовская Е. В., Герасимова С. В. и Хлесткина Е. К. Seedling biometry of the nud knockout and win1 knockout barley lines under ionizing radiation Plants, 2022. Vol. 11(19). 2474 (год публикации - 2022)
10.3390/plants11192474

7. Гордеева, Е.; Шоева, О.; Мурсалимов, С.; Адонина, И.; Хлесткина, Е. Fine points of marker-assisted pyramiding of anthocyanin biosynthesis regulatory genes for the creation of black-grained bread wheat (Triticum aestivum L.) lines Agronomy, 2022, 12, 2934 (год публикации - 2022)
10.3390/agronomy12122934

8. Стрыгина, К.; Хлесткина, Е. Flavonoid Biosynthesis Genes in Triticum aestivum L.: Methylation patterns in cis-regulatory regions of the duplicated CHI and F3H genes Biomolecules, 2022, 12, 689 (год публикации - 2022)
10.3390/biom12050689

9. Додуева И.Е., Лебедева М.А., Лутова Л.А. Фитопатогены и молекулярная мимикрия Генетика, 2022, т. 58, №6, с. 642-660 (год публикации - 2022)
10.31857/S0016675822060030

10. M.A. Lebedeva, D.A. Dobychkina, Ya.S. Yashenkova, D.A. Romanyuk, L.A. Lutova Local and systemic targets of the MtCLE35-SUNN pathway in the roots of Medicago truncatula Journal of Plant Physiology, Volume 281, 2023, 153922 (год публикации - 2023)
10.1016/j.jplph.2023.153922

11. Ю. В. Ухатова, М. В. Ерастенкова, Е. С. Коршикова, Е. А. Крылова, А. С. Михайлова, Т. В. Семилет, Н. Г. Тихонова, Н. А. Швачко, Е. К. Хлесткина Улучшение культурных растений при помощи системы CRISPR/Cas: новые гены-мишени Молекулярная биология, том 57, № 3, с. 387–410 (год публикации - 2023)
10.31857/S0026898423030151

12. Rozanova I.V.; Grigoriev Y.N.; Efimov V.M.; Igoshin A.V.; Khlestkina E.K. Genetic Dissection of Spike Productivity Traits in the Siberian Collection of Spring Barley Biomolecules, 13(6):909 (год публикации - 2023)
10.3390/biom13060909

13. Kudriashov A.A.; Zlydneva N.S.; Efremova E.P.; Tvorogova V.E.; Lutova L.A MtCLE08, MtCLE16, and MtCLE18 Transcription Patterns and Their Possible Functions in the Embryogenic Calli of Medicago truncatula Plants, 12(3):435 (год публикации - 2023)
10.3390/plants12030435

14. Gerasimova S.V.; Kolosovskaya E.V.; Vikhorev A.V.; Korotkova A.M.; Hertig C.W.; Genaev M.A.; Domrachev D.V.; Morozov S.V.; Chernyak E.I.; Shmakov N.A.; G.V. Vasiliev, A.V. Kochetov, J. Kumlehn, E.K. Khlestkina WAX INDUCER 1 Regulates β-Diketone Biosynthesis by Mediating Expression of the Cer-cqu Gene Cluster in Barley International Journal of Molecular Sciences, 24(7):6762 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24076762

15. М. М. Агаханов, Л.В. Багмет, Н.Г. Тихонова, М.В. Ерастенкова, Е.Н. Кислин, Ю.В. Ухатова, Е.К. Хлесткина Коллекция ВИР и гербарий ВИР (WIR) для сохранения, расширения и использования генетического разнообразия винограда Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции (год публикации - 2024)

16. А. С. Михайлова, Д. В. Соколова, Н. А. Швачко, В. С. Попов, Е. К. Хлесткина Аллельные различия ключевых генов биосинтеза беталаинов у контрастных по окраске корнеплода образцов свеклы столовой коллекции ВИР. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции (год публикации - 2024)

17. Khatefov EB, Goldstein VG, Krivandin AV, Wasserman LA. Main Characteristics of Processed Grain Starch Products and Physicochemical Features of the Starches from Maize (Zea mays L.) with Different Genotypes Polymers, 15(8):1976 (год публикации - 2023)
10.3390/polym15081976

18. Антонова Е.В., Шималина Н.С., Короткова А.М., Колосовская Е.В., Герасимова С.В., Хлесткина Е.К. Germination and growth characteristics of the nud knockout and win1 knockout barley lines under salt stress Plants, Plants 2024, 13, 1169 (год публикации - 2024)
10.3390/plants13091169

19. Кузнецова К.А., Додуева И.Е., Лутова Л.А. The homeodomain of the Raphanus sativus WOX4 binds to the promoter of the LOG3 cytokinin biosynthesis gene Ecological genetics, Ecological genetics 22(1):33-46 (год публикации - 2024)
10.17816/ecogen624893

20. Анастасия Егорова, Татьяна Зыкова, Кристиан Хертиг, Ирис Хоффи, Сергей В. Морозов, Елена И. Черняк, Артем Д. Рогачев, Анна М. Короткова, Александр Вихорев, Геннадий В. Васильев, Олеся Ю. Шоева, Йохен Кумлен, Софья Владимировна Герасимова и Елена Константиновна Хлесткина Accumulation of anthocyanin in the aleurone of barley grains by targeted restoration of the MYC2 gene International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 12705 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252312705

21. Крылова E.A., Хлесткина Е.К. TFL1-подобные гены у контрастных по типу роста образцов Vigna unguiculata (L.) Walp. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 2024;185(4):1-7 (год публикации - 2024)
10.30901/2227-8834-2024-4-1-7

22. Соколова Д.В., Швачко Н.А., Михайлова А.С., Попов В.С., Соловьева А.Е., Хлесткина Е.К. Characterization of betalain content and antioxidant activity variation dynamics in table beets (Beta vulgaris L.) with differently colored roots Agronomy, Agronomy 2024, 14, 999 (год публикации - 2024)
10.3390/agronomy14050999

23. Лебедева М.А., Добычкина Д. А., Баштовенко К. А., Петренко В. А., Рубцова Д. Н., Кочеткова Л. А., Азарахш М., Романюк Д. А., Лутова Л. А. MtCLE35 Mediates Inhibition of Rhizobia-Induced Signaling Pathway and Upregulation of Defense-Related Genes in Rhizobia-Inoculated Medicago truncatula Roots Journal of Plant Growth Regulation, Journal of Plant Growth Regulation (2024) 43:4941–4956 (год публикации - 2024)
10.1007/s00344-024-11448-y

24. Яковлева Д.В., Ефремова Е.П., Смирнов К.В., Симонова В.Ю., Константинов З.С., Творогова В.Е., Лутова Л.А. The WOX Genes from the Intermediate Clade: Influence on the Somatic Embryogenesis in Medicago truncatula Plants, Plants 2024, 13, 223. (год публикации - 2024)
10.3390/plants13020223

25. София Герасимова, Анна М. Короткова, Тамирес де С. Родригес, Александр Вихорев, Екатерина В. Колосовская, Геннадий В. Васильев, Майкл Мельцер, Кристиан В. Хертиг, Йохен Кумлен и Елена К. Хлесткина Shedding New Light on the Hull-Pericarp Adhesion Mechanisms of Barley Grains by Transcriptomics Analysis of Isogenic NUD1 and nud1 Lines International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 13108 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252313108

26. Крылова Е.А., Бурляева М.О., Творогова В.Е., Хлесткина Е.К. Contrast relative humidity response of diverse cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.) genotypes deep study using RNAseq approach International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2024, 25(20), 11056 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252011056

27. Ганчева М, Конькова Н, Соловьева А, Данилов Л, Гусев К, Лутова Л. Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the CLAVATA3ESR-Related Gene Family in Tiger Nut International Journal of Plant Biology, Int. J. Plant Biol. 2024, 15, 1054–1062 (год публикации - 2024)
10.3390/ijpb15040074

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
За отчетный период получены значимые результаты работ, направленные на модификацию при помощи редактирования зерновых, зернобобовых, овощных, бахчевых, плодовых и других культур, для того чтобы менять в заданную сторону биохимический состав семян, плодов или корнеплодов, отвечая требованиям рынка диетического и функционального питания и в целом требованиям современной пищевой промышленности; изменять габитус растений с целью снижения ресурсных затрат при производстве; контролировать форму и размер плодов; увеличивать продуктивность; влиять на скорость развития растений для диверсификации будущих сортов по срокам спелости в ответ на требования к конвейерному типу производства определенных культур и на повышение адаптации к неблагоприятным условиям среды. В рамках решения общей проблемы в сфере редактирования растений – генотип-специфической зависимости способности к соматическому эмбриогенезу, ограничивающей широкое внедрение технологий редактирования в практику, – выявлено три гена, кодирующих транскрипционные факторы из семейств WRKY, HD-ZIP и bZIP, сверхэкспрессия которых приводит к снижению количества соматических эмбрионов на эксплант у эмбриогенной линии люцерны. Таким образом, верифицированы ингибиторы соматического эмбриогенеза. В работах на ячмене: - Сравнение редактированных мутантных линий по гену Cle3 (ранее неизученный ген, относящийся к семейству, кодирующему сигнальные пептиды с доменом CLE – представители которого имеют потенциальное значение для управления продуктивностью и скороспелостью растений) в поколении Т3 с исходным генотипом Golden Promise выявило мутанты с достоверно сниженной массой проростков и корней. Сравнение полученных сведений по мутантным линиям по генам Myc2 и Ant2, вовлеченным в метаболизм растительных пигментов (накопление которых в съедобных частях растений играет важную роль в развитии направления функционального питания), указывает на частично общие (структурные гены биосинтеза флавоноидов) и частично специфические (регуляторные гены) компоненты генных сетей. Также для лучшего понимания функциональных связей и взаимодействий между генами, связанными с уникальными (не похожими на другие злаковые растения) механизмами формирования плёнчатости ячменя), в отчетный период на основе ранее полученных транскриптомных данных мутантной линии по гену Nud были проведены построение и анализ сетей взаимодействий белков (protein-protein interaction, PPI), найдены новые перспективные гены кандидаты. Обобщение данных по устойчивости проростков мутантных линий ячменя (по разным генам) и исходного сорта к разным типам абиотического стресса позволило ранжировать физиологические показатели и выявить характерные типы реакций для каждого вида стресса. В итоге на ячмене за период проекта получены и сохраняются для дальнейшего применения 29 мутантных редактированных линий (11 по Myc2, 8 по Ant2, 10 по Cle3), в изучении были 40 редактированных линий ячменя (включая указанные 29 и ранее полученные 11 по генам Nud и Win1, изучаемые в настоящем проекте). В результате трансформации чуфы (культуры, которая не являлась до проекта объектом генно-инженерных исследований) путем прокалывания апекса побега и нанесением агробактерии с вектором (с конструкцией для редактирования гена CNR2 – регулятора развития клубней) были детектированы корни с флуоресценцией красного белка, проведено генотипирование индивидуальных отобранных растений. Для кукурузы создан носитель служебных конструкций для нокаута генов с целью получения инбредных родительских линий для создания гибридов восковидной кукурузы – источника сырья для плазмы искусственной крови. В рамках исследования свеклы и редиса в отчетный период верифицированы на уровне фенотипа гены-мишени (ANT1 и ANT2) для контроля продуктивности свеклы столовой и размера корнеплодов, а также в другом отобраны носители служебных конструкций для мультиплексного нокаута генов CYP76AD5.1, CYP76AD5.2 и CYP76AD6 (негативные регуляторы синтеза бетанинов). Получены растения люцерны (поколения T2) с нокаутированным в результате редактирования геном MtTML2, характеризующиеся повышенной способностью к симбиозу с ризобиями. Для используемого сорта гороха Веста был разработан новый оптимизированный протокол для укоренения регенерантов и адаптации. На основе генотипирования полученных трансформированных растений в отчетный период отобраны индивидуальные укорененные растения – носители служебных конструкций для нокаута генов SBEI и SBEII (с целью улучшения биохимического состава гороха овощного). На основе сравнения данных транскриптомного анализа образцов вигны, имеющих разную архитектонику в условиях влажного климата, и морфометрических данных по этим генотипам, в отчетный период выделены 9 потенциальных генов-кандидатов для последующего нокаута. Одновременно на модельном гене, потенциально влияющем на архитектонику (TFL1) разработан эффективный протокол (с оригинальным способом подготовки эксплантов) для получения трансформантов вигны – носителей редактирующих конструкций: пошаговый протокол от введения в стерильные условия, до селективного отбора, укоренения, адаптации и получения в итоге фертильных трансформантов. На момент отчета имеются семена растений Т2. Аналогичный протокол позволил получить носители редактирующих конструкций для нокаута гена Е4 сои. Созданные и проверенные редактирующие конструкции для киви (ген Myb110), винограда (MybA1 и IdnDH), арбуза (ген О, син. ClFS1) использованы в отчетный период для успешной доставки при помощи модифицированных в настоящей работе эффективных пошаговых протоколов. Таким образом, к окончанию отчетного периода за время выполнения проекта получены значимые результаты по 12 культурам, более 20 генам-мишеням и на основе изучения 46 редактированных мутантов (по 4 культурам), 20 трансгенных линий со сверхэкспрессией (по 4 культурам), а также отобранных носителей редактирующих конструкций (по 8 культурам) для дальнейшего выделения мутантных линий. Результаты соответствуют заявленным в проекте и отличаются высокой степенью новизны - в проекте охвачены как новые в плане редактирования культуры, так и новые гены-мишени а также генотипы, впервые вовлекаемые в генно-инженерные исследования. Проведенные работы закладывают фундамент для масштабирования подобных работ в объеме требований современной селекции.

Публикации

Возможность практического использования результатов
В результате масштабного исследования с охватом более 20 генов-мишеней 12 различных растительных культур, получением и изучением более 40 редактированных линий (по 4 культурам), 20 трансгенных линий со сверхэкспрессией (по 4 культурам), а также отобранных носителей редактирующих конструкций (по 8 культурам) сформирован существенный технологический задел для дальнейших исследований и для дальнейшего экономического роста (при условии нормативной правовой базы, разрешающей применение редактированных линий сельскохозяйственных растений). Разработаны технологии модификации зерновых, бобовых, овощных, бахчевых, плодовых и других культур, для того чтобы менять в заданную сторону биохимический состав семян, плодов или корнеплодов, отвечая требованиям рынка диетического и функционального питания и в целом требованиям современной пищевой промышленности; изменять габитус растений с целью снижения ресурсных затрат при производстве; контролировать форму и размер плодов; увеличивать продуктивность; влиять на скорость развития растений и их адаптацию к неблагоприятным условиям среды.