КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 21-74-10115
НазваниеРазработка подходов к исследованию механизмов клеточной гибели и поиску мишеней лекарственных препаратов с использованием полногеномных коллекций штаммов дрожжей
Руководитель Егорова Анна Петровна, Кандидат химических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" , г Москва
Конкурс №61 - Конкурс 2021 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков
Ключевые слова грибковые патогены, противогрибковые, дрожжи, клеточная гибель, полногеномное исследование, механизм действия
Код ГРНТИ34.01.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Грибковые патогены человека вызывают заболевания, из-за которых ежегодно в мире гибнет ~1.5 млн человек. Помимо этого, новейшие данные указывают на то, что грибковые инфекции легких играют существенную роль в смертности больных с тяжелой формой течения коронавируса. При этом в клинической практике в настоящее время используется ограниченное число противогрибковых препаратов, нацеленных на небольшое число мишеней. Из-за этого растет число случаев заболевания резистентными формами патогенов, которые не поддаются терапии. Кроме того, грибы способны к образованию плотных колоний и биопленок, которые позволяют им более эффективно переживать воздействие лекарственных препаратов.
Таким образом, создание новых препаратов для терапии грибковых заболеваний и исследование механизмов их воздействия на клетки грибов является крайне актуальной областью исследований. Одним из наиболее сложных этапов таких работ является выявление механизмов действия потенциальных терапевтических молекул. Однако этот этап абсолютно необходим для их внедрения в клиническую практику, а также открывает возможность для направленного создания новых эффективных молекул, нацеленных на те же мишени.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются безвредным представителем одноклеточных грибов, которые при этом близкородственны патогенным дрожжам рода Candida. S. cerevisiae являются одним из наиболее изученных эукариотических организмов, сочетающих простоту фенотипического анализа и эффективность инструментов генной инженерии. Для S. cerevisiae, в частности, созданы систематические коллекции мутантов, у которых снижена или увеличена экспрессия почти всех индивидуальных генов, что позволяет проводить систематический анализ механизмов устойчивости или чувствительности к веществам с противогрибковой активностью и таким образом идентифицировать механизм их действия и потенциальные молекулярные мишени. По сравнению с классическими подходами, основанными на поиске устойчивых мутантов грибковых патогенов, использование модельного организма дает выигрыш как в стоимости, так и в детальности получаемых данных, поскольку оценивается и снижение и увеличение чувствительности каждого индивидуального штамма-мутанта.
На основе S. cerevisiae также созданы систематические коллекции штаммов, в которых продуцируются индивидуальные эндогенные белки, слитые с зеленым флуоресцентным белком (GFP). Использование таких коллекций позволяет проводить систематические исследования локализации и уровня синтеза белка в индивидуальных клетках с помощью флуоресцентной микроскопии и цитометриии. Подобный подход представляется крайне перспективным для исследования гетерогенных клеточных популяций грибов, например, колоний и сходных с ними биопленок, а также реакции клеток в составе этих популяций на воздействие лекарственных препаратов. Такие данные на сегодняшний день невозможно получить с использованием других распространенных протеомных методов, например, масс-спектрометрии.
Таким образом, цель предлагаемого проекта - разработка подходов для решения комплекса задач, связанных с созданием новых противогрибковых препаратов и изучением их механизмов действия. Эти подходы будут базироваться на применении систематических коллекций штаммов дрожжей S. cerevisiae. Проект включает в себя следующие задачи: 1) выявление механизмов действия конкретных новых перспективных противогрибковых препаратов 2) систематический поиск новых белков-мишеней, инактивация которых вызывает эффективную гибель клеток грибов 3) изучение адаптации клеток к влиянию противогрибковых препаратов в составе многоклеточных скоплений, которые играют значительную роль в формировании лекарственно-устойчивых форм грибковых патогенов.
В ходе работы будут изучены два перспективных соединения, созданных участниками нашего коллектива в ходе предшествующих работ. Одно из соединений проявляет активность против широкого круга грибковых патогенов и прошло полный цикл доклинических исследований. Второе соединение представляет собой уникальное по своим свойствам вещество, обладающее специфическим воздействием на грибы рода Aspergillus, при это убивая не только мицелий гриба, но и споры. На сегодняшний день это одно из немногих соединений, обладающих такой активностью. Оба исследуемых вещества обладают специфическими и оригинальными механизмами действия, что подтверждается предварительными данными об отсутствии перекрестной резистентности с известными противогрибковыми средствами. Для данных соединений будет проведен систематический поиск генов, влияющих на устойчивость/чувствительность клеток к данным препаратам. Также будет охарактеризован протеомный ответ клеток на воздействие этих препаратов. Полученные данные с высокой вероятностью позволят сформировать небольшой список мишеней-кандидатов, которые будут верифицированы с помощью исследования взаимодействия чистых белков с данными веществами.
В работе также будет разработан новый метод поиска перспективных мишеней для создания новых противогрибковых препаратов. С помощью коллекции температурочувствительных мутантов будет проведен систематический поиск жизненно важных белков, временная инактивация которых будет с высокой эффективностью убивать клетки дрожжей. Далее, с помощью высокопроизводительной проточной цитометрии, специфических флуоресцентных красителей, а также ряда других подходов, будет проведен детальный анализ механизмов гибели клеток в ответ на нарушения различных генов. Это представляет большой фундаментальный интерес, поскольку клетки грибов, подобно клеткам высших эукариот, могут умирать по механизмам, аналогичным некротической, апоптотической и лизосомо- или аутофаго-ассоциированной гибели, и конкретный механизм гибели зависит от характера повреждения клетки. Однако в данный момент нет четкого понимания, повреждение каких клеточных систем вызывает те или иные механизмы гибели.
Повышенная устойчивость к различным соединениям часто связана со способностью грибов образовывать многоклеточные скопления – колонии и биопленки. Условия роста в разных частях таких скоплений могут существенно отличаться, приводя к появлению популяций клеток, находящихся в разных физиологических состояниях. Это позволяет популяции в целом переживать широкий спектр воздействий. В ходе данной работы мы будем определять количество индивидуальных белков в разных областях колоний дрожжей в норме и при воздействии противогрибковых препаратов. Для этого будет использован систематическая коллекция штаммов дрожжей, продуцирующих белки, меченые GFP. Это позволит применить методы высокопроизводительной проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для точной оценки количества белка в отдельных клетках. Таким образом, впервые будет получена подробная информацию о протеомах разных популяций клеток в рамках одной колонии и о том, как эти популяции реагируют на воздействие противогрибковых препаратов.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ