Мукоадгезивные матрицы на основе морских полисахаридов для повышения эффективности противовирусных средств

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-74-20019

НазваниеМукоадгезивные матрицы на основе морских полисахаридов для повышения эффективности противовирусных средств

Руководитель Ермак Ирина Михайловна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук , Приморский край

Конкурс №51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые слова полисахариды, мукоадгезия, мукозальные системы, антивирусная активность, вирусы, наночастицы, пленки, гидрогели, клеточные культуры, проницаемость, иммуномодуляторы, спектроскопия, липосомы,

Код ГРНТИ34.39.49; 34.57.21

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Интерес к мукоадгезивным системам доставки веществ через слизистую оболочку обусловлен проблемами сегодняшнего дня, а именно передачей вирусов, в том числе коронавируса, воздушно-капельным путём и попаданием вируса в организм через мукозальные ткани носа, рта, верхних дыхательных путей, слизистую оболочку конъюнктивы, а также половых органов. Цель проекта заключается в предотвращении адсорбции вируса на слизистую оболочку организма, инактивации вирусных частиц, целевой доставки противовирусного препарата и усилению его действия с помощью мукоадгезивных систем, полученных в виде спреев, гидрогелей, плёнок. Слизистые оболочки органов человека представляют собой первую линию защиты и являются входными воротами как для возбудителей болезней, будь то вирусы или бактерии, так и лекарственных препаратов. Ингибировать или замедлить адсорбцию вируса на слизистую оболочку и доставлять лекарственное средство можно с помощью мукоадгезивных систем. Мукозальные матрицы, доставляющие лекарства к различным органам через их слизистую оболочку, позволяют увеличить эффективность используемого лекарственного препарата и характеризуются простотой и удобством применения через пероральный, буккальный, трансбуккальные и местные пути введения. Мукоадгезивность таких систем достигается путём создания гидрофильных матриц на основе полимеров, которые обеспечивают хорошую адгезию с муцином. Полимерные цепи должны быть подвижными и достаточно гибкими, чтобы проникать в слизь на определённую глубину, взаимодействовать с муцинами слизистой оболочки посредством водородных связей, электростатического и гидрофобного взаимодействий. В этом ряду природные полимеры имеют преимущества в силу их нетоксичности, биосовместимости, доступности, а также собственной физиологической активности. На фоне снижения эффективности традиционных методов терапии инфекционных заболеваний, роста устойчивости патогенных микроорганизмов к имеющимся лекарственным средствам разработка новых эффективных мукоадгезивных микробиоцидных систем на основе биологически-активных веществ природного происхождения для усиления противовирусного действия лекарственных субстанций особенно актуальна. Морские полисахариды, в частности сульфатированные галактаны красных водорослей - каррагинаны, благодаря безопасности их использования в пищевых и медицинских целях (USP35-NF30S1, BP2012, EP7), вязкоупругим свойствам, простому механизму термообратимого гелеобразования и способности образовывать комплексы с другим природным полимером - поликатионом хитозаном, являются перспективными полимерами для приготовления различных форм трансмукозных систем доставки лекарственных препаратов с широким спектром действия. Выбор каррагинанов и хитозанов для получения новых мукоадгезивных систем объясняется не только их уникальными физико-химическими свойствами, но и собственной биологической активностью, в частности противовирусной, антибактериальной, иммуномодулирующей проявление которых зависят от структурных особенностей полисахаридов. Последние, для каррагинанов определяются степенью сульфатирования, местоположением сульфатных групп моносахаридным составом и молекулярной массой, а для хитозанов – степенью дезацетилирования и молекулярной массой. Анализ литературных данных свидетельствует о перспективности этих полисахаридов, как антивирусных средств, которые могут блокировать прикрепление вируса и последующее его проникновение в клетку-хозяина. Неспецифическое взаимодействие вирусного гликопротеина с гепаринсульфатом на поверхности клетки является первым шагом в проникновение вируса в рецепторы хозяина. Как структурный имитатор гепаринсульфата, каррагинан может образовывать комплекс с вирусными гликопротеинами, предотвращая их связывание непосредственно с внеклеточным гепаринсульфатом. Известная активность каррагинанов против широкого спектра вирусов, в том числе респираторных, предполагает усиление фармакологического действия противовирусных субстанций, включённых в полисахаридную матрицу. Так коммерческий йота-каррагинан, благодаря его эффективной активности против различных респираторных вирусов, был одобрен в ЕС, Азии и Австралии как составная часть препаратов для лечения простуды и связанных с ними заболеваний. Однако, природные каррагинаны, как правило, имеют гибридную структуру, представленную комбинацией нескольких типов, и она зависит как от видовой принадлежности водорослей, так и условий их обитания. Преимуществом данного проекта является возможность использования широкого по структурному разнообразию набора каррагинанов, выделяемых участниками проекта из красных водорослей дальневосточных морей, и их низкомолекулярных производных. Использование различных физико-химических методов анализа (спектроскопии, динамического светорассеяния, электрокинетических измерений, вискозиметрии и реологии, разных видов микроскопии, рентгеноструктурного анализа) и широкого набора биологических тестов позволит выбрать из полисахаридов наиболее перспективные для создания мукоадгезивных систем и включения в них лекарственных субстанций. Сочетание мукоадгезивных свойств полисахаридов, которые должны блокировать посадку вируса на слизистую, и широкого спектра их активностей, в частности противовирусной и антибактериальной, с фармакологическим действием выбранных лекарственных средств позволит улучшить терапевтический эффект последних, благодаря комплексному воздействию. При этом включение терапевтического препарата в полимерную матрицу будет способствовать его растворимости и защищать активное соединение от деградации, усиливать абсорбцию. В пользу этого свидетельствуют полученные нами ранее данные по улучшению растворимости, защиты от окисления, снижению токсического действия эхинохрома – антиоксидантной лекарственной субстанции отечественного препарата Гистохром®. Важным представляется получение удобной офтальмологической формы эхинохром, в связи с успешным фармакологическим эффектом препарата Гистохром®, который применяется в виде инъекций при офтальмопатологиях, и обнаруженной противовирусной активности самого эхинохрома. Научная новизна запланированной работы заключается в получении различных гидрофильных матриц на основе полисахаридов в виде липосом, гелей, макросфер, пленок, наночастиц, которые будут способствовать доставке и усилению фармакологического действия внесённых в них известных противовирусных препаратов (например, таких как рибовирин и ацикловир). Противовирусная, антибактериальная и иммуномодулирующая активности будут исследованы в экспериментах in vitro, ex vivo с применением различных клеточных культур, проточной цитометрии, методов анализа флуоресцентного изображения иммунокомпетентных клеток. Оценка эффективности полученных мукоадгезивных систем будет исследована по их способности, защищать слизистые поверхности от экзогенных раздражителей - вирусной и бактериальной природы, ингибировать развитие инфекционного процесса и воздействовать на иммунную систему организма. Оценка противовирусной активности полисахаридов и их матриц с лекарственной субстанцией будет проводиться на клеточных линиях Vero, инфицированных ДНК- содержащими вирусами (вирусы простого герпеса 1 и 2 типа - ВПГ-1 и ВПГ-2) и РНК-содержащими вирусами (энтеровирус – ECHO-1 и человеческий коронавирус HCoV – OC43). Будет определено их влияние на разные стадии жизненного цикла этих вирусов с применением вирусологических, спектрофотометрических и иммунофлуоресцентных методов. Для оценки эффективности фармакологического действия полученных систем будут проведены эксперименты in vivo на белых мышах, инфицированных ВПГ, а также коронавирусом мышей (MCoV – Murine coronavirus), безвредным для человека. Важной составляющей данного проекта будут исследования in vitro, проводимые на базе ОИ ЦКТ ИНЦ, г. Санкт-Петербург с использованием различных культур клеток. Высокая технологичность процесса исследований позволит проводить быстрый скрининг одновременно нескольких препаратов. На клеточных культурах будет проведена оценка цитотоксичности и биосовместимости полисахаридов и их матриц, с применением количественных и качественных методов оценки, определен характер взаимодействия эпителиальных клеток слизистой ткани с полисахаридными матрицами и их комбинаций с противовирусными средствами, что будет иметь практическое значение при выборе и обосновании использования мукоадгезивных систем. Можно ожидать, что применение сочетанного действия полисахаридных матриц и противовирусных средств позволит создать лекарственные формы, способные удерживаться на слизистой и замедлять высвобождение действующего вещества, предупреждать вирусную и бактериальную инфекции, корректировать иммунную систему организма. Получение глазных лекарственных пленок и гелевых макросфер на основе полисахаридов решит проблему удобного использования и пролонгированного поступления лекарственного средства в ткани глаза, наночастиц и липосом для создания противовирусных и антибактериальных спреев для полости рта и носоглотки, гидрогелей и пленок для препаратов местного и вагинального использования.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Ирина Ермак, Станислав Анастюк, Анна Кравченко, Вильям Хелберт, Валерий Глазунов, Андрей Шуьгин, Павел Спирин, Владимир Прассолов New Insights into the Structure of Kappa/Beta-Carrageenan: A Novel Potential Inhibitor of HIV-1 Международный журнал молекулярных наук, 2021, 22, 12905 (год публикации - 2021)

2. И.М. Ермак, М.И. Горбач, И.А. Карнаков, В.Н. Давыдова, Е.А.Пименова, Д.А.Чистюлин, В.И.Исаков, В.П. Глазунов Carrageenan gel beads for echinochrome inclusion: Influence of structural features of carrageenan ELSEVIER, v.272, 15,11847 (год публикации - 2021)
10.1016/j.carbpol.2021.118479

3. Ермак И.М., Давыдова В.Н., Володько А.В. Mucoadhesive marine polysaccharides Marine Drugs, № 8, Т. 20, С. 522 (год публикации - 2022)
10.3390/md20080522

4. Крылова Н.В., Кравченко А.О., Юнихина О.В., Потт А.Б., Лихацкая Г.Н., Володько А.В., Запорожец Т.С., Щелканов М.Ю., Ермак И.М. Influence of the structural features of carrageenans from red algae of the Far Eastern Seas on their antiviral properties Marine drugs, № 1, Т. 20, С. 60 (год публикации - 2022)
10.3390/md20010060

5. Володько А.В., Давыдова В.Н., Петрова В.А., Романов Д.П., Пименова Е.А., Ермак И.М. Comparative analysis of the functional properties of films based on carrageenans, chitosan, and their polyelectrolyte complexes Marine Drugs, №12, Т. 19., С. 704 (год публикации - 2021)
10.3390/md19120704

6. Ермак И.М., Кравченко А.О., Хасина Э.И., Менчинская Е.С., Пислягин Е.А., Соколова Е.В., Лихацкая Г.Н., Аминин Д.Л. The anti-inflammatory effect of carrageenan/echinochrom complex at experimental endotoxemia International Journal of Molecular Sciences, № 19, Т. 23, С. 11702 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms231911702

7. Крылова Н.В., Горбач В.И., Иунихина О.В., Потт А.Б., Глазунов В.П., Кравченко А.О., Щелканов М.Ю., Ермак И.М. Antiherpetic activity of carrageenan complex with echinochrome A and its liposomal form International Journal of Molecular Sciences, № 24, Т. 23, С. 15754 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms232415754

8. Володько А.В., Ермак И.М. Сравнение реологических свойств нагруженных эхинохромом плёнок на основе каррагинанов различных структурных типов XX Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 4–8 сентября 2023 г. : материалы конф. – Владивосток : ТИБОХ ДВО РАН, С. 78 (год публикации - 2023)
10.47471/20_2023_09_04_08_0

9. Ермак И.М. Морские полисахариды как мультифункциональные мукоадгезивные системы для доставки и/или усиления эффективности лекарственных средств Фундаментальная гликобиология – 2023 : материалы VI Всероссийской конференции, Мурманск, 11–15 сентября 2023 г : Мурманск : Изд-во МАУ, С. 31 (год публикации - 2023)

10. Володько А.В., Сон Э.Ю., Ермак И.М. Сульфатированный полисахарид κ-каррагинан как мукоадгезивная матрица в виде пленок и губок для доставки лекарственных средств Фундаментальная гликобиология – 2023 : материалы VI Всероссийской конференции, Мурманск, 11–15 сентября 2023 г : Мурманск : Изд-во МАУ, С. 29 (год публикации - 2023)

11. Давыдова В.Н., Крылова Н.В., Иунихина О.В., Володько А.В., Пименова Е.А., Щелканов М.Ю., Ермак И.М. Physicochemical properties and antiherpetic activity of κ-carrageenan complex with chitosan Marine Drugs, № 4, Т. 21, С. 238 (год публикации - 2023)
10.3390/md21040238

12. Володько А.В., Сон Э.Ю., Глазунов В.П., Давыдова В.Н., Александер-Синклер Э.И., Александрова С.А., Блинова М.И., Ермак И.М. Carrageenan films as promising mucoadhesive ocular drug delivery systems Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Vol. 237, P. 113854. (год публикации - 2024)
10.1016/j.colsurfb.2024.113854

13. Володько А.В., Кравченко А.О., Китань С.А. Атомно-силовая микроскопия каррагинанов красной водоросли Mazzaella parksii Научная конференция, посвященная 60-летию ТИБОХ ДВО РАН и 95-летию со дня рождения его основателя академика Г.Б. Елякова, ТИБОХ ДВО РАН. Материалы конференции / Владивосток, 12–13 сентября 2024. – Владивосток. , С. 48 (год публикации - 2024)
10.47471/2694.2024.57.80.001

14. Александер-Синклер Э.И., Александрова С.А., Дарвиш Д.М., Едоменко Н.В., Горбач В.И., Кравченко А.О., Ермак И.М., Михайлова Н.А., Блинова М.И. In vitro скрининг потенциальных систем доставки эхинохрома для лечения заболеваний глаз Цитология, Номер 3, Том 66, Страницы 274-288 (год публикации - 2024)
10.31857/S0041377124030085

15. Менчинская Е.С., Горбач В.И. , Пислягие Е.А., Горпенченко Т.Я., Пименова Е.А., Гузова И.В., Аминин Д.Л., Ермак И.М. Interaction of Liposomes Containing the Carrageenan/ Echinochrome Complex with Human HaCaT Keratinocytes In Vitro Marine Drugs , Mar. Drugs 2024, 22, 561 (год публикации - 2024)
https://doi. org/10.3390/md22120561

16. Кравченко А.О., Крылова Н.В., Иунихина О.В., Анастюк С.А., Исаков В.В., Глазунов В.П., Володько А.В., Китань С.И., Щелканов М.Ю., Ермак И.М. Structure and properties of polysaccharides from tetrasporophytes of Mazzaella parksii InternationalJournal of Biologica lMacromolecules (ELSEVIER), 300. 140178 (год публикации - 2025)

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Установлены элементы тонкой структуры высокомолекулярного полисахарида (461 кДа), выделенного с высоким выходом (68%) из красной водоросли Mazzaella parksii (Gigartinaceae) Дальневосточных морей. Показано, что этот полисахарид представляет собой ассоциат сульфатированных гетерогенных галактанов - каррагинанов (КНов), которые в основном имеют гибридную структуру, построенную из каппа-, йота- и ню- звеньев КН; галактана- лямбда-КН, содержащего небольшие количества каппа-, йота-КН и их биосинтетические предшественники; и галактана, дисахаридные звенья которого построены из гамма-КН, несульфатированного КН, c небольшим содержанием сульфатированных галактоз, вероятно, являющихся структурными элементами кси-, пси- и омикрон-КН. Отработаны условия хранения полисахаридных матриц, удобных для наружного и местного применения в виде липосом, гелевых композитов и плёнок на основе КН, содержащих лекарственную субстанцию эхинохром (ЭХ). Показано, что ЭХ не окисляется в липосомах и плёнках при их хранении в течение 6 месяцев, а в гелевых макросферах в течение года. Изучено взаимодействие каппа-КН с препаратом Ацикловир® (АЦВ) методом квантовой химии и показано, что среди возможных мономолекулярных комплексов каппа-КН с АЦВ главным комплексом, с максимальной по абсолютной величине полной энергией Гиббса, является комплекс в котором AЦВ образует одну межмолекулярную водородную связь и четыре координационные связи с КН. Энтальпия этого комплекса = 13.6 ккал/моль, тогда как энтальпия комплекса лямбда-КН с АЦВ, составила -19 ккал/моль. Изучена противогерпетическая активность липосом, содержащих комплексы κаппа-КН/АЦВ с разным соотношением составляющих его компонентов, которую оценивали по индексу селективности SI. Предварительная обработка клеток (профилактическое действие) липосомами с КН/АЦВ при соотношении компонентов 10:1 и 5:1 показала их выраженное ингибирующее действие (SI53 и SI42, соответственно). При обработке инфицированных клеток (лечебное действие) более высокий уровень антигерпетической активности (SI 131) проявляли липосомы с КН/АЦВ при соотношении 5:1. Методом молекулярного докинга изучено взаимодействие КНов с двумя ключевыми мишенями SARS-CoV-2: с рецептор-связывающим доменом (RBD) вируса и клеточным рецептором ACE2. Показано, что взаимодействие КН с ACE2 происходит за счёт образования H-донорных, H-акцепторных и ионных связей и наибольшая энергия связи КН с ACE2 получена для каппа-КН. КН связываются как с АСЕ2, так и RBD, но наибольшую аффинность они проявляют по отношению к клеточному рецептору ACE2, что может обуславливать ингибирование прикрепления вируса к клеткам. Изучена противовирусная активность в отношении SARS-CoV-2 комплекса КН/ЭХ на клетках Vero E6 по оценке уровня подавления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса (SI) и репликации вируса, с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ) по снижению уровня вирусной РНК (коэффициенту ингибирования (IC, %). Комплекс КН/ЭХ наиболее эффективно подавлял репликацию SARS-CoV-2 (SI 77) при предварительной обработке вируса (прямое вирулицидное действие), проявляя в 2 раза более высокую противовирусную активность по сравнению с исходными компонентами: КН и ЭХ. Предварительная обработка клеток КН/ЭХ комплексом (профилактическое действие) показала более слабый эффект (SI 20), чем КН (SI 70), что может быть объяснено цитотоксичностью ЭХ. Значительное ингибирование репликации SARS-CoV-2 наблюдалось при одновременной обработке клеток вирусом и комплексом (SI 38). Результаты метода ОТ-ПЦР показали, что при прямом воздействии на вирус и одновременной обработке клеток вирусом и комплексом, КН/ЭХ - комплекс подавлял репликацию вируса более эффективно, чем его компоненты, тогда как предварительная обработка клеток КН вызывала более значительное снижение уровня вирусной РНК, по сравнению с комплексом. Продолжена разработка in vitro модели вирусной инфекции, индуцированной штаммом SARS-CoV-2 на культуре клеток А549. Установлено, что КН не проявляет токсичности на клетках А549 (СС50 более 2000 мкг/мл), в отличии от ЭХ (СС50 = 20 мкг/мл), что обуславливает и более высокую, по сравнению с КН, цитотоксичность комплекса каппа-КН/ЭХ (более 500 мкг/мл). На клетках кератиноцитов человека HaCa изучена способность липосом, содержащих комплекса КН/ЭХ, подавлять воспалительный эффект, который обычно сопутствует инфекционным заболеваниям. Оценку противовоспалительной активности липосом проводили по параметрам лизосомальной регуляции, повышению внутриклеточного уровня АФК и повышению регуляции синтеза NO в воспаленных клетках кожи, под действием воспалительных агентов - ЛПС или E. coli., используя методы флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии. Комплекс КН/ЭХ, инкапсулированный в липосомы, способен проникать и накапливаться в кератиноцитах человека и предварительная инкубация клеток с липосомами приводит к снижению лизосомальной активности (на 24,9%), уменьшению уровня АФК (на 23%) и NO в клетках кожи при воспалении, вызванном ЛПС или E. coli. Липосомы также значительно усиливают миграцию кератиноцитов, подавленных высокими концентрациями ЛПС. В лабораторных условиях разработан технологический регламент на производство КН для использования в медицинских целях (Приложение 8). Описаны условия подготовки сырья, экстракции полисахарида, его очистки и фракционирования, с целью получения КН, отвечающего по основным характеристикам (молекулярная масса, степень сульфатированя), всем международным требованиям, предъявляемым к пищевым и медицинским изделиям. На базе ОИ ИНЦ РАН в условиях in vitro проведено изучение цитотоксичности полисахаридных матриц в форме липосом, содержащих комплексы КН/ЭХ и КН/АЦВ, а также проницаемости (адгезивности) лекарственной субстанции из липосом, содержащих комплекс КН/АЦВ в отношении культивируемых клеток слизистой оболочки губ человека hLMSC. Показано, что жизнеспособность клеток, культивируемых в течение 24 ч в модельных средах содержащих липосомы, ниже, чем в контроле, а при культивировании в течение 48 ч сопоставима с контролем. При этом липосомы, содержащие КН/АЦВ оказывали на клетки более выраженный цитотоксический эффект, чем липосомы с КН/ЭХ. Для оценки адгезивности и проницаемости лекарственной субстанции, меченой FITC, использовали методы флуоресцентной и световой микроскопии. Выявлено, что метка (FITC) детектируется в клетках, инкубированных со всеми объектами исследования, несущими эту метку. Полный Отчет ОИ ИНЦ РАН прилагается. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту: https://vestiprim.ru/livettv/149080-vmesto-ukolov-i-tabletok-unikalnyj-desant-budet-dostavljat-lekarstva-v-organizm-pacienta.html?_utl_t=tm https://new.ras.ru/activities/news/preodolenie-slozhnostey-s-dostavkoy-oftalmologicheskikh-preparatov/

Публикации