Механизмы устойчивости сибирской лягушки (Rana amurensis) к аноксии

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-74-20050

НазваниеМеханизмы устойчивости сибирской лягушки (Rana amurensis) к аноксии

Руководитель Шеховцов Сергей Викторович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" , Новосибирская обл

Конкурс №51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова сибирская лягушка, Rana amurensis, амфибии, гипоксия, аноксия, транскриптомика

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Общеизвестно, что человек, как и большинство наземных животных, крайне чувствителен к гипоксии. Даже кратковременное (несколько минут) ограничение количества потребляемого кислорода влечет за собой необратимые патологические изменения в некоторых органах и, как следствие, смерть. Локальное ограничение количества кислорода (ишемия) – также часто встречающаяся патология человека. В то же время среди позвоночных существуют виды, способные адаптироваться к продолжительной и глубокой гипоксии; хорошо изученные модели такой устойчивости – некоторые виды черепах и рыб. До недавнего времени амфибии считались относительно малоустойчивыми к гипоксии. Однако недавно члены нашего коллектива показали, что сибирская лягушка Rana amurensis способна выживать до полугода в воде с почти полным отсутствием кислорода при малых положительных температурах. Важно, что сибирская лягушка сохраняет способность двигаться и реагировать на стимулы, в отличие, например, от черепах, которые при сходных концентрациях кислорода погружаются в полный анабиоз. Цель предлагаемого проекта – изучить молекулярные основы устойчивости амфибий к аноксии. Для достижения этой задачи планируется изучить динамику изменений экспрессии генов в нормоксии, во время адаптации к гипоксии, в состоянии глубокой аноксии и при выходе из нее. Эта работа будет проведена на высоко устойчивом к гипоксии виде (сибирская лягушка R. amurensis), среднеустойчивом (остромордая лягушка R. arvalis) и неустойчивом (дальневосточная лягушка R. dybowskii). Полученные результаты позволят нам выявить генные пути и биохимические механизмы, использующиеся для адаптации к аноксии. Полученные данные будут подкреплены протеомными и метаболомными данными. Судя по опубликованным работам на других позвоночных, их устойчивость к гипоксии обусловлена уже существующими генными путями, присутствующими у всех представителей типа, в том числе и у человека. В связи с этим, данная работа может пролить свет на деятельность гомологичных генов и генных путей у всех позвоночных. Предлагаемый проект представляется очевидно важным в свете интереса к путям реакции на гипоксию у человека, за изучение которых вручена Нобелевская премия по физиологии и медицине 2019 года.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Шеховцов С.В., Булахова Н.А., Центалович Ю.П., Зеленцова Е.А., Мещерякова Е.Н., Полубоярова Т.В., Берман Д.И. Biochemical Response to Freezing in the Siberian Salamander Salamandrella keyserlingii Biology, 11, 10: 1172 (год публикации - 2021)
10.3390/biology10111172

2. Д.Н. Смирнов, С.В. Шеховцов, А.А. Шипова, Г.Р. Газизова, Е.И. Шагимарданова, Д.И. Берман, Н.А. Булахова, Е.Н. Мещерякова, Т.В. Полубоярова, Е.Е. Храмеева, С.Е. Пельтек De novo assembly and analysis of the transcriptome of the Siberian wood frog Rana amurensis Вавиловский журнал генетики и селекции (год публикации - 2022)
10.18699/VJGB-22-07

3. Булахова Н., Шишикина К. Pre-hibernation energy reserves and their consumption during freezing in the moor frog Rana arvalis in Siberia The European Zoological Journal, V. 89. №. 1. P. 556-567. (год публикации - 2022)
10.1080/24750263.2022.2060357

4. Шеховцов С.В., Булахова Н.А., Центалович Ю.П., Зеленцова Е.А., Мещерякова Е.Н., Полубоярова Т.В., Берман Д.И. Metabolomic Analysis Reveals That the Moor Frog Rana arvalis Uses Both Glucose and Glycerol as Cryoprotectants Animals, V. 12 № 10, article no.1286 (год публикации - 2022)
10.3390/ani12101286

5. Булахова Н.А., Мещерякова Е.Н., Берман Д.И. Pallas’ spadefoot Pelobates vespertinus (Pelobatidae, Amphibia) tolerates extreme hypoxia The European Zoological Journal, 90(1), 431-442. (год публикации - 2023)
10.1080/24750263.2023.2217201

6. Шеховцов С.В., Булахова Н.А., Центалович Ю.П., Зеленцова Е.А., Осик Н.А., Мещерякова Е.Н., Полубоярова Т.В., Берман Д.И. Metabolomic Profiling Reveals Differences in Hypoxia Response between Far Eastern and Siberian Frogs Animals, 13(21) (год публикации - 2023)
10.3390/ani13213349

7. Берман Д.И., Булахова Н.А., Мещерякова Е.Н., Рогуленко А.В., Шишикина К.И. Чесночница Палласа (Pelobates vespertinus (Pallas 1771), Amphibia, Pelobatidae) – второй вид амфибий, переносящий экстремальную гипоксию ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, том 102, № 9, с. 1028–1045 (год публикации - 2023)
10.31857/S0044513423090040

8. Шеховцов С. В., Воронцова Ю. Л., Слепнева И. А., Смирнов Д. Н., Храмеева Е. Е., Шатунов А., Полубоярова Т. В., Булахова Н. А., Мещерякова Е. Н., Берман Д. И., Глупов В. В. The Impact of Long-Term Hypoxia on the Antioxidant Defense System in the Siberian Frog Rana amurensis Biochemistry (Moscow), 2024, Vol. 89, No. 3, pp. 441-450 (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.1134/S0006297924030052

9. Булахова Н.А., Мещерякова Е.Н. Стратегия зимовки дальневосточной жерлянки Bombina orientalis f sylvatica (Amphibia, Anura) Зоологический журнал, (2024) Т. 103. № 10. (год публикации - 2024)

10. Шеховцов С. В., Булахова Н. А., Центалович Ю. П., Осик Н. А., Мещерякова Е. Н., Полубоярова Т. В., Берман Д. И. Metabolomic Profiles of Siberian Wood Frog Rana amurensis in Hypoxia and Upon Reoxygenation Biochemistry (Moscow), том 89, выпуск 12, 2024 г. (год публикации - 2024)

11. Шеховцов С. В., Булахова Н. А., Центалович Ю. П., Осик Н. А., Мещерякова Е. Н., Полубоярова Т. В., Берман Д. И. Metabolic stability of the Pallas’ spadefoot Pelobates vespertinus under extreme hypoxia Journal of Comparative Physiology B, (2024) 194:855–867 (год публикации - 2024)
0.1007/s00360-024-01584-y

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Для изучения реакции сибирской лягушки на гипоксию на уровне транскрипции мы секвенировали ее геном (Illumina, MinION) и транскриптом (Illumina). Геномные данные (772 млн парных коротких и 5.6 млн длинных прочтений) использовали для картирования транскриптомных данных (26 РНК-библиотек из разных органов, ~19 млн парных прочтений на образец). Анализ экспрессии генов выявил изменения для многих генов, включая транскрипционные факторы. При реоксигенации во всех тканях повышалась экспрессия цитохрома P450 (возможно, для метаболизма липидов) и белков теплового шока HSP70 (для ренатурации белков и предотвращения апоптоза). Реакция ключевых регуляторных путей оказалась неоднозначной. Экспрессия HIF1A, главного фактора ответа на гипоксию у человека, снижалась в мозге после реоксигенации. Гены окислительного фосфорилирования и гликолиза в мозге и сердце демонстрировали снижение экспрессии при реоксигенации, а не повышение, как ожидалось. Другие гены HIF-пути не меняли экспрессию. В цикле Кребса в мозге увеличивалась экспрессия изоцитратдегидрогеназы, а в сердце снижалась экспрессия цитратсинтазы и оксоглутаратдегидрогеназы при реоксигенации. Отметим, что изменений в уровнях экспрессии генов, участвующих в пути гликолиза, не наблюдалось, несмотря на то, что вероятнее предположение об усилении их транскрипции в ответ на гипоксию. По всей видимости, усиление гликолиза может происходить уже на белковом уровне путем активации уже синтезированных белков. В целом, можно заключить, что достоверные изменения уровней экспрессии могут наблюдаться лишь для небольшого ряда генов. Это можно объяснить, во-первых, существованием иных методов регуляции количества и активности обсуждаемых белков. Во-вторых, может иметь место некоторая инерционность уровней транскриптов, что связано как с ее усилением/ослаблением, так и со скоростью деградации транскриптов. Был проведен комплексный анализ ответа амфибий на гипоксию и реоксигенацию. Прослежена динамика метаболитов сибирской лягушки Rana amurensis на разных стадиях гипоксии и при выходе из нее (1 час реоксигенации). Показано, что основное увеличение концентраций метаболитов происходит сразу после начала гипоксии, с не слишком значительным последующим накоплением в течение нескольких недель. Вероятнее всего, метаболизм подавляется при длительной гипоксии до уровней, достаточных для использования уровней расхода энергии и, таким образом, накопления потенциально токсичных молекул. Быстрого восстановления контрольных уровней при реоксигенации не наблюдалось. Были выявлены группы веществ, демонстрирующих схожие закономерности. Выявлено, что при реоксигенации уровень сукцината резко снижается только в мозге, но не в сердце и в печени. Анализ метаболитов показал накопление сукцината, ацетилкарнитина, глицерина, аланина и других аминокислот в гипоксии, а также снижение уровней НАД и АТФ. В печени и сердце наблюдалось быстрое накопление глицерина и 2,3-бутандиола в гипоксии, причем глицерин быстро снижался при реоксигенации, а 2,3-бутандиол – нет. В мозге накапливались аминокислоты, сукцинат и ГАМК. Также было проведено исследование метаболома чесночницы Палласа Pelobates vespertinus в гипоксии и контроле. Чесночница Палласа – единственный известный вид амфибий, способный переносить глубокую гипоксию в воздухе. Мы изучили метаболом печени, сердца и мозга чесночницы Палласа после месячного воздействия гипоксии, при этом уровень кислорода был снижен примерно до одной десятой нормального содержания в воздухе. По сравнению с сибирской лягушкой, у этого вида был выявлен слабый метаболомный ответ на гипоксию, и большинство важных веществ или не сильно меняли уровень экспрессии через 27 дней гипоксии, или вовсе не демонстрировали изменений. Концентрации конечных продуктов гликолиза (лактата и аланина) увеличились лишь незначительно по сравнению с другими амфибиями в условиях гипоксии, и накопление сукцината зафиксировано не было. Более того, не было замечено значительных изменений в содержании аденозиновых фосфатов. Эти результаты согласуются с предыдущим исследованием, которое показало, что у чесночницы Палласа относительно небольшие запасы гликогена и жира перед зимой по сравнению с другими лягушками. Похоже, что этот вид сохраняет энергию зимой, минимизируя свою метаболическую активность. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что выживание P. vespertinus в гипоксических условиях в первую очередь зависит от угнетения метаболизма, а не от значительных энергетических запасов. Проведен анализ окислительных повреждений и активностей некоторых антиоксидантных ферментов у сибирской лягушки в контроле, гипоксии и реоксигенации, а также у дальневосточной лягушки в контроле и реоксигенации и у чесночницы Палласа в контроле и гипоксии. Показано, что в печени, сердце, крови, легком и мозге сибирской лягушки средние количества малонового диальдегида (маркера окислительных повреждений) снижаются в опыте по сравнению с контролем; в мозге и сердце эти различия достоверны. Те же закономерности верны и для печени дальневосточной лягушки и чесночницы Палласа. Таким образом, оказывается, что ни гипоксия, ни 1 час реоксигенации не приводят к усилению окислительных повреждений, несмотря на то что по крайней мере для реоксигенации ожидалась обратная картина. Активности антиоксидантных ферментов (глутатион-S-трансферазы и каталазы) также снижались в этих условиях. Эти неожиданные результаты сходны с полученными на красноухой черепахе (также устойчивой к гипоксии), и свидетельствуют о том, что реоксигенация у устойчивых к гипоксии холоднокровных не приводит к ожидаемому «взрыву» свободных радикалов. Достигается это не за счет усиления антиоксидантной системы (она, напротив, снижает активность), а предположительно за счет иной организации митохондриального метаболизма по сравнению с млекопитающими, что требует дальнейшего изучения.

Публикации