Изучение молекулярных основ механизма действия противогрибковых антибиотиков макролидов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-74-20102

НазваниеИзучение молекулярных основ механизма действия противогрибковых антибиотиков макролидов

Руководитель Омельчук Ольга Александровна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе" , г Москва

Конкурс №51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова противогрибковые антибиотики, химическая модификация, макролиды, спектр действия, механизм действия, эргостерин, холестерин, ионные каналы, мембранная активность

Код ГРНТИ31.23.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Грибковые инфекции поражают более миллиарда человек и являются причиной более 11,5 млн. инфекций, угрожающих жизни, и более 1,5 млн. смертей в год. Особенно уязвимы к инвазивным грибковым заболеваниям люди с ослабленным иммунитетом, в том числе, пациенты с ВИЧ-инфекцией, после трансплантации органов или во время химиотерапии при онкологических заболеваниях. Заболеваемость системными микозами у иммунокомпрометированных пациентов ассоциируется с недопустимо высокими уровнями летальности, достигающими в ряде случаев 70-90%. В настоящее время к клиническому применению для лечения инвазивных микозов разрешены всего 4 класса противогрибковых препаратов: флуцитозин, азолы, эхинокандины и полиеновые антибиотики (амфотерицин В), при этом до 10-30% клинически значимых грибковых патогенов устойчивы к противогрибковым препаратам, за исключением амфотерицина В. Пандемия новой коронавирусной инфекции COVID-19, объявленная в 2020 году, привела к резкому увеличению случаев назначения антибиотиков для лечения или предотвращения развития бактериальных и грибковых осложнений на фоне вирусной инфекции, что, по общему мнению специалистов, в недалеком будущем приведет к значительному росту числа резистентных штаммов и еще больше обострит проблему резистентности, как к антибактериальным, так и к противогрибковым агентам. Помимо широкого распространения резистентности сложность химиотерапии грибковых заболеваний связана с образованием биопленок - высокоорганизованных, подвижных, непрерывно изменяющихся гетерогенных сообществ, состоящие как из активно функционирующих клеток, так из покоящихся форм, заключенных в экзополимерный матрикс. Изучение биопленок в настоящее время вызывает огромный интерес исследователей, главным образом, в связи с тем, что этот способ существования микроорганизмов создает большие проблемы в медицинской практике. Способность грибов формировать биопленки рассматривается в настоящее время как фактор их патогенности. Установлено, что многие инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского и или имплантированного оборудования (препараты искусственной вентиляции легких, линзы, катетеры, протезы, искусственные клапаны сердца), обусловлены способностью микроорганизмов расти в виде биопленок на поверхностях этих устройств, при этом грибки, живущие внутри биопленок, проявляют значительно более высокую устойчивость – до 1000 раз - к антибиотикам и другим лекарственным препаратам. По этим причинам исследования в области новых потенциальных противогрибковых препаратов в настоящее время включают поиск соединений, активных в отношении штаммов, резистентных к существующим антибиотикам, а также изучение воздействия потенциальных кандидатов на грибковые биопленки. С учетом перечисленных выше факторов одним из наиболее перспективных классов для поиска нового поколения противогрибковых антибиотиков являются противогрибковые полиеновые макролиды группы амфотерицина В. Несмотря на более чем шестидесятилетнюю историю клинического применения, амфотерицин В является золотым стандартом в лечении тяжелых грибковых инфекций, так как обладает широким спектром противогрибковой активности, а клинически значимая лекарственная устойчивость к нему достаточна редка. Тем не менее, применение амфотерицина В ограничено его низкой растворимостью в водных средах и серьезными побочными эффектами, такими как гемолитическая токсичность и нефротоксичность. Общей структурной особенностью полиеновых макролидов является наличие 20-44-членного макролактонового кольца, содержащего 3-8 сопряженных двойных связей. Несмотря на длительную историю изучения, механизм действия противогрибковых полиенов до сих пор окончательно не установлен. Описаны различные модели механизма действия амфотерицина В, включая образование ионных каналов после связывания со стеринами, присутствующими в клеточных мембранах, образование макромолекулярных комплексов с эргостерином на поверхности грибковой мембраны, индукция оксидативного стресса и целых ряд других. Ключевыми невыясненными вопросами остаются необходимость образования пор в мембране для проявления противогрибковой активности, влияние самоагрегации антибиотиков на токсичность в отношении клеток хозяева, пути повышения селективности связывания с эргостерином, факторы, влияющие на способность действовать на грибы в составе биопленок и целых ряд других. В то же время знание молекулярных основ действия этих антибиотиков на клетки является важным этапом создания новых эффективных противогрибковых агентов. Предлагаемый проект направлен на систематические исследования по синтезу, изучению биологической активности и механизма действия новых противогрибковых препаратов, полученных химической модификацией полиеновых макролидов. Особое внимание будет уделено поиску и изучению производных, которые способны подавлять образование биопленок и убивать микробные популяции внутри грибковых биопленок. Найденные соединения-кандидаты, а также данные о биологических свойствах новых производных будут использованы для разработки нового поколения высокоактивных химиотерапевтических препаратов для лечения инфекций, вызванных грибковыми патогенами. Предлагаемый подход открывает широкие перспективы получения фундаментальных знаний о взаимосвязи структура–активность для данного класса противогрибковых препаратов, разработки способов повышения эффективности и избирательности действия антибиотиков, а также адаптации защитных механизмов клетки к внешним воздействиям.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Тевяшова А.Н., Бычкова Е.Н., Затонский Г.В., Грамматикова Н.Э., Ефимова С.С., Остроумова О.С. Study of molecular bases of the mechanism of action of antifungal macrolide antibiotics FEBS Open Bio, V. 11 (Suppl. 1), pp. 319–320 (год публикации - 2021)
10.1002/2211-5463.13205

2. Тевяшова А.Н., Ефимова С.С., Александров А.И., Гази Э., Бычкова Е.Н., Соловьева С.Е., Затонский Г.В., Грамматикова Н.Э., Деженкова Л.Г., Переверзева Э.Р., Исакова Е.Б., Остроумова О.С., Омельчук О.А., Муравьева В.В., К Semi-synthetic amides of polyene antibiotic natamycin ACS Infectious Diseases (год публикации - 2023)

3. Тевяшова А.Н., Ефимова С.С., Александров А.И., Омельчук О.A., Гази Э.С.М.О., Бычкова Е.Н., Затонский Г.B., Грамматикова Н.Э., Деженкова Л.Г., Соловьева С.Е., Остроумова О.С., Щекотихин А.E. Semisynthetic Amides of Amphotericin B and Nystatin A1: A Comparative Study of In Vitro Activity/Toxicity Ratio in Relation to Selectivity to Ergosterol Membranes Antibiotics, V. 12(1). P. 151 (год публикации - 2023)
10.3390/antibiotics12010151

4. Омельчук О.А., Тевяшова А.Н., Ефимова С.С., Грамматикова Н.Э., Бычкова Е.Н., Затонский Г.В., Деженкова Л.Г., Савин Н.А., Соловьева С.Е., Остроумова О.С., Щекотихин А.Е. A Study on the Effect of Quaternization of Polyene Antibiotics’ Structures on Their Activity, Toxicity, and Impact on Membrane Models Antibiotics, 13(7), 608 (год публикации - 2024)
10.3390/antibiotics13070608

5. Омельчук О.А., Бычкова Е.Н., Ефимова С.С,, Грамматикова Н.Э., Затонский Г.В., Деженкова Л.Г., Соловьева С.Е., Остроумова О.С., Тевяшова А.Н., Щекотихин А.Е. Mono-N-alkylation of amphotericin B and nystatin A1 and its amides: effect on the in vitro activity, cytotoxicity and permea-bilization of model membranes Antibiotics, 13(12), 1177 (год публикации - 2024)
10.3390/antibiotics13121177

6. Омельчук О.А., Ефимова С.С., Грамматикова Н.Э., Бычкова Е.Н., Остроумова О.С., Тевяшова А.Н. Atypical effects of lipophilic natamycin derivatives on lipid membranes FEBS Open Bio (год публикации - 2024)
10.1002/2211-5463.13837

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Методами молекулярной динамики и квантовой химии определен ряд параметров взаимодействия природных полиеновых антибиотиков и их полусинтетических производных со стеринами (холестерин, эргостерин) в липидном окружении, имитирующем мембраны клеток грибов и млекопитающих. Показано, что трансмембранные каналы, образованные полусинтетическими производными амфотерицина В, имеют заметно больший радиус, чем каналы, образованные самим амфотерицином В. Установлено, что взаимное сродство антибиотиков и стеринов обуславливается гидрофобными взаимодействиями и сетью слабых водородных связей, причем в случае введения заместителей в структуру природного антибиотика формируется дополнительный контакт между соседствующими молекулами полиена, что, вероятно, увеличивает стабильность канала. Толщина мембраны определенно влияет на стабильность комплекса антибиотик-стерин. Так, в случае с эргостерином утоньшение мембраны значительно ослабляет комплекс, в то время как для холестерина, напротив, к такому результату приводит утолщение мембраны, что соответствует экспериментальным данным. Структурно влияние толщины мембраны на стабильность комплекса выражается в изменении угла наклона стерина к нормали мембраны и, соответственно, их с антибиотиком взаимной ориентации. Осуществлен синтез N-(2-гидроксиэтил)амидов амфотерицина В, нистатина и натамицина, а также их N-алкилированные производные, содержащие заместители различной природы. Для новых соединений изучена противогрибковая активность на штаммах грибов и дрожжей. Установлено, что N-этаноламиды полиеновых антибиотиков проявляли более высокую активность по сравнению с их природными аналогами, что согласуется с ранее опубликованными данными. Моно-N-алкилированные производные, содержащие N-(гидроксиэтил)амино)этильный фрагмент в остатке микозамина также продемонстрировали довольно высокую противогрибковую активность. Однако, вопреки нашим ожиданиям, объединение этих двух успешных модификаций в одной структуре не привело к синергетическому эффекту. Другие бис-модифицированные производные, содержащие ароматический (2-фторбензильный) и алкильный липофильный (С10) заместители были гораздо менее активны, чем исходные антибиотики. В серии производных нистатина и натамицина наименее цитотоксичными оказались N-(2-гидроксиэтил)амиды; моно-N-алкилирование микозамина N-(гидроксиэтил)амино)этильный фрагментом приводило к незначительному снижению цитотоксичности, а бис-модифицированные производные оказались несколько более токсичными, чем N-(2-гидроксиэтил)амиды. Среди всех протестированных производных амфотерицина, N-(2-гидроксиэтил)амино)этил AmB проявил наименьшую цитотоксичность в МТТ-тесте и в тесте на гемолитическую активность. Поскольку микроорганизмы склонны к образованию биопленок и в естественных условиях редко существуют в виде суспендированном виде, наиболее активные производные из синтезированной серии полусинтетических полиенов были протестированы в отношении грибов в составе биопленок. Результаты исследования не позволили выявить какого-либо нового лидера по антибиопленочной активности – все производные показали сравнимую с природными антибиотиками активность или немного уступали (за исключением одного производного AmB, впервые полученного на предыдущих этапах выполнения проекта). При этом можно сказать, что моно-модифицированные полиены 4-9 несколько превосходят по активности бис-модифицированные производные 10а, 11а и 12а.Антибиопленочное действие наиболее активного производного амфотерицина В (N-(2-гидроксиэтил)амино)этил AmB) было подробно изучено в 2022г. В рамках проекта также проведено исследование мембранной активности производных полиеновых антибиотиков на модельных липидных мембранах, плоских липидных бислоях и одноламеллярных липосомах, имитирующих состав мембраны клеток грибов и млекопитающих. Для производных ряда амфотерицина В проведена оценка функционирования одиночных ионных каналов, формируемых методом их инкорпорирования в плоские липидные бислои и измерения токов проводимости при фиксации трансмембранного напряжения. Результаты исследования показали, что среди производных амфотерицина наилучший результат по селективности к мембранам, содержащим эргостерин, показал N-(2-гидроксиэтил)амино)этил AmB. Производные Nys обладали сниженной способностью высвобождать кальцеин из липидных везикул обеих композиций, за исключением N-(2-гидроксиэтил)амида Nys в липосомах POPC/ERG, которые проявляли более высокую селективность в отношении мембран, содержащих эргостерин. Эти результаты хорошо коррелируют с данными об активности и цитотоксичности in vitro. Также было экспериментально установлено, что способность антибиотиков высвобождать флуоресцентный маркер из везикул, содержащих эргостерин, увеличивалась с увеличением толщины модельной мембраны; обратная тенденция прослеживалась в случае холестерин-содержащих мембран. Зависимость была более выраженной для AmB, чем для амфамида.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты реализации проекта имеют значимость для сферы разработки лекарств, поскольку содержат ценные данные, которые будут полезны для разработки новых противогрибковых препаратов на основе полиновых антибиотиков; тем не менее, делать выводы о возможности непосредственного практического использования результатов на данном этапе преждевременно.