РЕДОКС-ГОМЕОСТАЗ ВНУТРЕННИХ КОМПАРТМЕНТОВ КЛЕТКИ

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-74-20178

НазваниеРЕДОКС-ГОМЕОСТАЗ ВНУТРЕННИХ КОМПАРТМЕНТОВ КЛЕТКИ

Руководитель Люблинская Ольга Геннадьевна, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук , г Санкт-Петербург

Конкурс №51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые слова генетически кодируемые биосенсоры, HyPer, перекись водорода, редокс-гомеостаз, клеточные компартменты

Код ГРНТИ34.19.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Окислительно-восстановительные реакции являются одним из наиболее распространенных типов химических реакций в живых клетках. Масштабная программа исследований внутриклеточных редокс-процессов, проведенная в прошлом, позволила разобраться в многообразии биологически значимых внутриклеточных окислителей и редокс-активных ферментативных систем, функционирующих в живой клетке. Значительная доля этих исследований была проведена в системе in vitro. Актуальная задача сегодняшнего дня, на решение которой и направлен настоящий проект – транслировать полученные знания в систему in vivo и выяснить, как это многообразие редокс-активных соединений сосуществует и взаимодействует друг с другом в живой клетке, как формируется редокс-ландшафт внутри отдельных органелл клетки, и в какой степени он является зависимым от редокс-гомеостаза соседних областей. Настоящий проект предполагает проведение комплексного исследования, призванного детализировать характеристики редокс-гомеостаза в цитоплазме, ядре и митохондриях живых клеток в условиях физиологической нормы, а также в условиях окислительного стресса, вызванного эндогенными или экзогенными факторами. Методической основой проекта является оригинальный подход, разработанный авторами, позволяющий с помощью генетически-кодируемого биосенсора перекиси водорода HyPer (Belousov et al., Nat Methods. 2006), слитого с сигналом локализации в разных клеточных органеллах, проводить количественные измерения ключевых параметров редокс-гомеостаза внутренних компартментов живых клеток: базальной и индуцированной стрессом молярной концентрации перекиси водорода, а также констант скоростей редокс-реакций, протекающих с участием пероксида. Проведение подобных экспериментов на фоне агентов, ингибирующих или стимулирующих различные редокс-активные ферментативные системы клетки, а также использование в экспериментах клеток с нокдауном генов-участников этих ферментативных путей, позволит определить номенклатуру ферментативных путей, контролирующих редокс-гомеостаз в клеточных компартментах. Проведенные исследования позволят впервые в мире определить, как изменяется базальная концентрация перекиси водорода в ядре, митохондриях и цитоплазме в условиях повседневного культивирования клеток, какие ферменты антиоксидантной защиты и тиол-дисульфидного обмена контролируют уровень внутриклеточной перекиси водорода в этих компартментах и какие ферменты вовлечены в процесс восстановления тиоловых групп редокс-активных белков. С использованием палитры siRNA планируется выяснить, насколько возмущения окислительно-восстановительного метаболизма, вызванные снижением уровня ключевых редокс-регуляторов и происходящие внутри одного компартмента клетки, влияют на редокс-гомеостаз соседних компартментов. Помимо этого, редокс-гомеостаз клеточных компартментов будет охарактеризован в условиях локального суб-цитотоксического и цитотоксического окислительного стресса, вызванного нарушением работы клеточных митохондрий. В качестве индукторов митохондриальной дисфункции будут использованы различные агенты, ингибирующие дыхательную цепь и/или индуцирующие состояние повышенной проницаемости митохондриальной мембраны. Планируется выяснить, как распределяется перекись водорода по клетке в условиях митохондриальной дисфункции и какое превышение уровня эндогенного пероксида над уровнем физиологической нормы приводит к фатальным последствиям – повреждению ДНК и гибели клеток. В итоге, в результате выполнения проекта будет составлена «редокс-карта» клетки, отражающая концентрацию перекиси водорода, скорость реакций тиол-дисульфидного обмена в разных компартментах, перечислены участники основных ферментативных путей, контролирующих редокс-гомеостаз этих компартментов в нормальных физиологических условиях, а также в условиях окислительного стресса, вызванного экзогенными или эндогенными факторами.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Люблинская О.Г., Корниенко Ю.С., Иванова Ю.С. , Пуговкина Н.А., Алексеенко Л.Л., Люблинская Е.А., Тюряева И.И., Смирнова И.С., Гринчук Т.М., Шорохова М.А., Красненко А.Ю., Плотников Н.А., Никольский Н.Н. Induction of Premature Cell Senescence Stimulated by High Doses of Antioxidants Is Mediated by Endoplasmic Reticulum Stress International Journal of Molecular Sciences, Т. 22. № 21:11851 (год публикации - 2021)
10.3390/ijms222111851

2. Зенин В.В., Иванова Ю.С., Пуговкина Н.А., Шатрова А.Н., Аксенов Н.Д., Тюряева И.И., Кунеев И.К., Журавлев А.Д., Осяева Е.Н., Люблинская Е.А., Газиова И.Ф., Гуриев Н.А., Люблинская О.Г. Resistance to H2O2-induced oxidative stress in human cells of different phenotypes Redox Biology (год публикации - 2022)

3. Кожухарова И.В., Минкевич Н.В., Алексеенко Л.Л., Домнина А.П., Люблинская О.Г. Paracrine and Autocrine Effects of VEGF Are Enhanced in Human eMSC Spheroids International journal of molecular sciences, Int. J. Mol. Sci. v.23 №22 p.14324 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms232214324

4. Тюряева И.И., Люблинская О.Г. Expected and unexpected effects of pharmacological antioxidants International Journal of Molecular Sciences, Int J Mol Sci. 2023 Jun; 24(11): 9303. (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24119303

5. Люблинская О.Г. Генетически кодируемый биосенсор HyPer как инструмент для количественного определения внутриклеточного уровня перекиси водорода Цитология, №3, том 66, с. 223—233 (год публикации - 2024)
10.31857/S0041377124030026

6. Иванова Ю.И., Шорохова М.А., Пуговкина Н.А., Кожухарова И.В., Алексеенко Л.Л., Гурьев Н.А., Кунеев И.К., Домнина А.П., Гринчук Т.М., Земелько В.И., Люблинская О.Г. Partial Reprogramming Exerts a Rejuvenating Effect on Human Mesenchymal Stem Cells That Underwent Replicative Senescence in Culture International Journal of Molecular Sciences, MDPI, Basel, 25(23), 12533 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252312533

7. Журавлев А.Д., Эзериня Д., Иванова Ю.С., Гурьев Н.А., Пуговкина Н.А., Шатрова А.Н., Аксёнов Н.Д., Мессенс Й., Люблинская О.Г. HyPer as a tool to determine the reductive activity in cellular compartments Redox Biology, v. 70, p. 103058 (год публикации - 2024)
10.1016/j.redox.2024.103058

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект нацелен на определение количественных и качественных параметров редокс-гомеостаза в различных компартментах клеток человека. Основная задача проекта в 2024 году – охарактеризовать вклад ключевых пероксидаз (пероксиредоксинов и глутатионпероксидаз) в регуляцию редокс-гомеостаза цитоплазмы, ядра и митохондрий клеток К-562 в нормальных физиологических условиях, а также в условиях окислительного стресса, индуцированного перекисью водорода (Н2О2). Для оценки влияния на внутриклеточный редокс-метаболизм пероксиредоксинов (Prx) в экспериментах использовался приём siRNA-индуцированного нокдауна Prx1, Prx2 и Prx1,2, а для оценки влияния глутатионпероксидаз (GPx) – ингибитор синтеза основного кофактора GPx, глутатиона, а также siRNA-индуцированный нокдаун GPx4. Для характеристики редокс-гомеостаза клеток были проведены тесты с использованием HyPer, генетически-кодируемого биосенсора Н2О2, проведён количественный ПЦР-анализ, проанализирована пролиферативная активность и жизнеспособность клеток. Установлено, что в нормальных физиологических условиях, подавление Prx1-, Prx2-, Prx1,2- и GPx-зависимой пероксидазной активности не приводит к существенному нарушению редокс-гомеостаза в цитоплазме, ядре и митохондриях, а также к изменению физиологических параметров клеток. По всей видимости, базальный редокс-гомеостаз поддерживается благодаря кумулятивной активности всех внутриклеточных редокс-регуляторов. В то же самое время, обнаружено, что в условиях окислительного стресса, GPx- и Prx1,2-зависимая пероксидазная активность значимо влияет на способность клеток утилизировать избыточную Н2О2. Вклад в этот процесс GPx, в протестированном диапазоне генотоксических и суб-генотоксических окислительных нагрузок, не зависит от интенсивности стресса, тогда как вклад Prx1 и Prx2 снижается – предположительно, благодаря эффекту инактивирующего гиперокисления этих ферментов. Помимо этого, снижение внутриклеточного содержания Prx1,2 приводит в условиях стресса к повышению тиоредоксин-зависимой дисульфидредуктазной активности – причём, как в цитоплазме, так и в ядре клеток – предположительно, благодаря снижению нагрузки на систему тиоредоксина, мишенями которой являются Prx1,2. Полученные в 2024 году результаты свидетельствуют, таким образом, о нетривиальной взаимосвязи между активностью Prx1,2 и эффективностью антиоксидантной защиты клеток – уменьшение содержания Prx1,2 снижает пероксидазную, но повышает дисульфидредуктазную активность в ядре и цитоплазме клеток человека. Результаты работы по проекту в отчётном году существенно расширяют существующие представления о влиянии тиол-пероксидаз на регуляцию метаболизма Н2О2 в клетках человека.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Возможность практического использования результатов проекта связана с перспективами создания на основе разработанных в проекте аналитических методов клеточных тест-систем для скрининга фармакологических препаратов с антиоксидантной активностью